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文檔簡介
1、目的:樹突狀細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,是連接先天免疫和獲得性免疫的重要橋梁,其中漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞是IFN-α天然產(chǎn)生細(xì)胞,具有重要的抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用。MicroRNA(miRNA)是近幾年發(fā)現(xiàn)的主要起負(fù)反饋調(diào)作用的小分子。本研究旨在探索miRNA pDC分泌IFN-α中的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而進(jìn)一步闡明pDC在SLE發(fā)病過程中的可能機(jī)制。
方法:磁珠分選方法分選出純度較高的pDC,予以TLR7刺激活化pDC;應(yīng)用Applie
2、d Biosystem公司低密度芯片分析、比較SLE患者和正常人pDC miRNA表達(dá)譜的差異;篩選出刺激前后有顯著變化的miRNAs,利用生物信息學(xué)分析、雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)、實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot等方法研究其參與pDC分泌IFN-α的分子機(jī)制;應(yīng)用流式細(xì)胞分選術(shù)分選狼瘡鼠的pDC,予以TLR9刺激活化,比較狼瘡鼠和對(duì)照鼠C57/BL6分泌IFN-α的差異。
結(jié)果:磁珠分選獲得的pDC純度≥95%,TLR
3、7刺激4h后pDC合成IFN-αmRNA的水平達(dá)到高峰;正常人pDC在TLR7刺激活化后誘導(dǎo)表達(dá)的miRNAs數(shù)目增加4倍左右,而SLE患者pDC基礎(chǔ)狀態(tài)表達(dá)的miRNAs數(shù)目要比正常人pDC基礎(chǔ)狀態(tài)表達(dá)的miRNAs數(shù)目增加約2倍,提示SLE外周血pDC存在一定程度的活化。在pDC活化后表達(dá)水平顯著增加的miRNAs中包括has-miR-155*和has-miR-155,進(jìn)一步分析顯示pDC活化早期has-miR-155*顯著增加,4
4、h后表達(dá)迅速下調(diào),與IFN-αmRNA表達(dá)水平一致,而has-miR-155表達(dá)則活化后期增加明顯。miRNA調(diào)控靶基因提示has-miR-155*的靶基因?yàn)镮RAKM,進(jìn)而促進(jìn)pDC分泌IFN-α,而has-miR-155則作用于TAB2,起著負(fù)向調(diào)節(jié)pDC分泌IFN-α的作用,通過這一組miRNA的精細(xì)調(diào)控來避免機(jī)體免疫系統(tǒng)過度活化。pDC活化誘導(dǎo)產(chǎn)生的KHSRP是導(dǎo)致has-miR-155*和has-miR-155表達(dá)水平成反向的
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