MicroRNA調(diào)控的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)(EMT)在塵肺發(fā)病中的作用研究.pdf

1、塵肺是我國危害最嚴(yán)重，患病率最高的職業(yè)病，是由于長期吸入矽塵，煤矽塵，煤塵，金屬塵等無機(jī)粉塵導(dǎo)致在肺內(nèi)潴留繼而引起的以肺組織彌漫不可逆性纖維化為主要特征的全身性疾病。我國報(bào)告的塵肺病例尤以煤工塵肺和矽肺的發(fā)病率最高。迄今為止，塵肺病沒有特效的治療方法，疾病不僅僅給個(gè)人造成身體危害，給家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，還給社會(huì)帶來重大的疾病負(fù)擔(dān)，造成國民經(jīng)濟(jì)較大的損失，因此研究疾病的發(fā)病機(jī)制，對于塵肺病的早期診斷、治療及預(yù)防起著十分重要的作用。

2、　　有研究表明，肺泡上皮細(xì)胞到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肺纖維化中有著舉足輕重的作用。EMT的過程可以簡單歸納為上皮細(xì)胞失去極性，標(biāo)記物 E-鈣粘素（E-cadherin）等表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞骨架重新排列，形態(tài)改變?yōu)榧忓N形，間葉標(biāo)記物波形蛋白（vimentin），α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等表達(dá)上調(diào)，最后具有間葉細(xì)胞的特性，致使多種細(xì)胞外基質(zhì)沉積。既往研究顯

3、示在這個(gè)復(fù)雜的過程中，TGF-β是其關(guān)鍵啟動(dòng)因子。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為19-25nt內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，通過與其目的基因mRNA3’非編碼區(qū)（3’UTR）特定區(qū)域配對結(jié)合，使得目的基因降解又或是抑制目的基因的翻譯，進(jìn)而在基因轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)。近年來，陸續(xù)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)多種miRNA可以通過調(diào)控某些靶基因從而影響EMT的發(fā)生和發(fā)展，目前研究比較成熟的主要有miR-200家族，m

4、iR-29家族和miR-21。盡管這幾個(gè)miRNA與器官纖維化的研究已經(jīng)開展了不少，且調(diào)控EMT的相關(guān)報(bào)道也在不斷擴(kuò)展，但這些miRNA在塵肺病的發(fā)生和進(jìn)展過程中作用的研究還很缺乏。本研究試圖探討EMT在塵肺病的發(fā)生與發(fā)展中的機(jī)制以及miRNA在此過程中的調(diào)控作用。
　　本研究包括三個(gè)部分，第一部分通過檢測塵肺病人、健康接塵工人和未接塵健康對照人群全血中EMT相關(guān)標(biāo)記物的mRNA水平，血漿中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)以及miR-20

5、0c、miR-29c和miR-21的水平，分析EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)量與三種miRNA的關(guān)系，確認(rèn)EMT現(xiàn)象與塵肺發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，獲得EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化與三種miRNA的關(guān)系。第二部分采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，用呼吸性標(biāo)準(zhǔn)石英粉塵體外刺激肺上皮細(xì)胞，檢測 EMT相關(guān)基因和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平，并通過拮抗TGF-β分析TGF-β在石英粉塵誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT中的作用。第三部分采用第二部分模型，用石英粉塵刺激肺上皮細(xì)胞

6、，測定miR-200c、miR-29c和miR-21的表達(dá)，通過觀察添加miR-200c和miR-29c的模擬物以及miR-21的抑制劑后 EMT相關(guān)基因 mRNA水平和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步分析三種miRNA對 EMT的調(diào)控作用及其對纖維化的影響，為塵肺發(fā)病機(jī)制研究提供新線索。
　　第一部分 MiR-200c、 miR-29c和miR-21介導(dǎo)EMT在塵肺發(fā)病中的作用
　　目的：通過病例對照研究探討miR-2

7、00c、miR-29c和miR-21及其介導(dǎo)的EMT在塵肺病中的表現(xiàn)及作用。
　　方法：研究病例為湖北省黃石地區(qū)222例男性塵肺患者（矽肺78例、煤工塵肺144例），均由當(dāng)?shù)赜匈Y質(zhì)的職業(yè)病診斷結(jié)構(gòu)確診。根據(jù)性別和年齡匹配與病例來自同一地區(qū)的218例健康接塵工人和225例健康不接塵對照，收集研究對象個(gè)人基本信息和職業(yè)接塵信息并采集外周血樣提取 RNA，分離血漿。采用 RT-PCR法測定血樣中EMT相關(guān)標(biāo)志物的mRNA及血漿中miR-

8、200c、miR-29c、miR-21的表達(dá)，用ELISA方法檢測血漿中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平。
　　結(jié)果：1.與健康對照相比，塵肺患者與健康接塵工人全血中上皮標(biāo)志物E-cadherin，Zo-1基因 mRNA表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA，Vimentin基因 mRNA表達(dá)升高。調(diào)控EMT的重要通路：TGF-β/Smad依賴通路上的TGF-β1，Smad2，Smad3基因 mRNA表達(dá)升高，抑制基因Smad7 mRNA表達(dá)降低

9、；非TGF-β/Smad依賴通路上的Notch-1，Jagged-1，β-catenin基因 mRNA表達(dá)都有升高趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示EMT現(xiàn)象在塵肺患者中存在，TGF-β/Smad依賴通路和非TGF-β/Smad依賴通路均可能參與粉塵引起的EMT。
　　2.塵肺患者和健康接塵工人血漿中EMT啟動(dòng)因子TGF-β，細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白包括MMP-2、MMP-9、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ的水平明

10、顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明塵肺患者存在細(xì)胞外基質(zhì)沉積現(xiàn)象。
　　3.塵肺患者和健康接塵工人血漿中miR-200c及miR-29c的表達(dá)量要明顯低于健康對照組，miR-21的水平要顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.矽肺病患者和煤工塵肺患者全血中EMT相關(guān)基因mRNA以及三種miRNA的水平不盡相同。矽肺組的變化趨勢要強(qiáng)于煤工塵肺組，特別是在三種miRNA的表達(dá)上，矽肺組的

11、miR-200c和miR-29c的水平要比煤工塵肺組更低，miR-21的水平要比煤工塵肺組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示三種miRNA在不同類型粉塵導(dǎo)致的不同類型的塵肺中存在差異。
　　5.在所有樣本中，miR-200c、miR-29c及miR-21的表達(dá)與EMT相關(guān)基因mRNA及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平有相關(guān)性（P<0.05）。特別是與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)量相關(guān)系數(shù)較大，r值在0.595-0.778之間。

12、>　　結(jié)論：EMT過程不僅在塵肺發(fā)病后存在，且在接塵發(fā)病前就已經(jīng)開始。MiR-200c、miR-29c及miR-21參與調(diào)控塵肺病中EMT的發(fā)生，起著重要的作用。EMT程度在不同類型粉塵導(dǎo)致的不同類型的塵肺中存在差異。
　　第二部分石英粉塵致肺部上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生在纖維化中的作用研究
　　目的：通過體外細(xì)胞模型研究石英粉塵致肺部上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生在纖維化中的作用，并探討TGF-β對此作用的影響。
　　方法：以兩種肺

13、部上皮細(xì)胞（A549, BEAS-2B）作為靶細(xì)胞。選取粒徑小于1μm的標(biāo)準(zhǔn)石英粉塵配置成濃度為0，12.5，25，50，100，200μg/cm2的粉塵懸液，分別染毒兩種細(xì)胞24h后，RT-PCR方法檢測EMT及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因mRNA的水平，ELISA方法檢測上清液中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)。為分析TGF-β的作用，上述染塵細(xì)胞組分別加入15，30ng/ml兩種濃度TGF-β抑制劑LY2157299，重復(fù)測定相關(guān)指標(biāo)。
　　

14、結(jié)果：石英粉塵能夠誘導(dǎo)A549和BEAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin，Zo-1基因mRNA表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA，Vimentin基因mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EMT啟動(dòng)因子TGF-β及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因MMP-2、MMP-9、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ無論是mRNA水平還是蛋白水平都隨粉塵濃度的升高而增加，呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩種細(xì)胞的變化趨

15、勢較一致。
　　加入TGF-β抑制劑LY2157299后，上皮標(biāo)志物mRNA降低的趨勢以及間質(zhì)標(biāo)志物mRNA升高的趨勢得到控制，細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因mRNA及蛋白水平升高的趨勢也得到了緩解。提示TGF-β是石英粉塵致肺上皮細(xì)胞EMT發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
　　結(jié)論：石英粉塵可以誘導(dǎo)A549和BEAS-2B兩種肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT變化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。阻斷TGF-β的表達(dá)，EMT及細(xì)胞外基質(zhì)沉積程度得到控制，提示石英粉塵能夠

16、誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，且此過程可部分通過釋放TGF-β來實(shí)現(xiàn)。
　　第三部分 MiR-200c、miR-29c、miR-21調(diào)控石英粉塵致肺部上皮細(xì)胞EMT的作用研究
　　目的：體外細(xì)胞模型探討miR-200c、miR-29c、miR-21在石英致肺部上皮細(xì)胞EMT發(fā)生中的作用。
　　方法：用上述6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)石英粉塵懸液分別加入A549和BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)24h，RT-PCR方法檢測細(xì)胞miR-200c、m

17、iR-29c和miR-21的水平。同時(shí)，設(shè)置分別添加miR-200c、miR-29c模擬物和miR-21抑制劑后的濃度梯度染塵組，測定指標(biāo)同第二部分。
　　結(jié)果：隨石英粉塵濃度的增加，兩類細(xì)胞的miR-200c、miR-29c水平降低，miR-21水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。添加miR-200c、miR-29c模擬物和抑制miR-21后，檢測EMT相關(guān)基因mRNA，細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)

18、志物E-cadherin，Zo-1基因mRNA表達(dá)降低的趨勢得到控制，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA，Vimentin基因mRNA表達(dá)增加的趨勢得到緩解。EMT啟動(dòng)因子TGF-β及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因MMP-2、MMP-9、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ無論是mRNA水平還是蛋白水平隨粉塵濃度升高而增加的趨勢明顯減弱，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：MiR-200c、miR-29c和miR-21參與調(diào)控石英粉塵誘導(dǎo)

19、的肺上皮細(xì)胞發(fā)生的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。通過對這三種miRNA的干預(yù)可以降低石英粉塵導(dǎo)致的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，此結(jié)果對塵肺病的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。
　　本研究通過人群研究和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)性粉塵特別是石英粉塵能通過釋放TGF-β從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，且這個(gè)過程受到三種miRNA：miR-200c、miR-29c和miR-21的調(diào)控。研究的創(chuàng)新特色包括：1.采用人群研究和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究方法；2.據(jù)我們所知，本研究首次采用