RasGRP1在濕疹發(fā)病中的作用及機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 RasGRP1在濕疹患者外周血單個核細胞及T細胞中的表達及意義
　　目的：研究 RasGRP1在濕疹患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的表達。純化 PBMC中的T細胞,進一步研究 RasGRP1在濕疹患者外周血T細胞中的表達,并探討其意義。
　　方法：使用Ficoll法提取濕疹患者及正常人外周血中的PB

2、MC,采用免疫磁珠分選法從 PBMC中分選 T細胞,驗證 T細胞的分選純度。使用RT-PCR及Western Blot方法檢測濕疹患者及正常人外周血 PBMC和T細胞中RasGRP1的表達。
　　結果：使用Ficoll法提取的外周血 PBMC的純度接近100％,而使用免疫磁珠分選法分選 T細胞,其純度能達到98％以上。在 PBMC中,濕疹患者 RasGRP1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平明顯高于正常人,在純化后的T細胞中,濕疹患者

3、RasGRP1的mRNA和蛋白的表達水平也明顯高于正常人。
　　結論：使用免疫磁珠分選外周血 PBMC中的T細胞純度較高。濕疹患者外周血 PBMC及T細胞中RasGRP1的表達水平較正常人均增高,提示 T細胞中RasGRP1的異常表達可能是濕疹發(fā)病過程中的一個重要因素。
　　第二部分 地塞米松對濕疹患者 T細胞中RasGRP1表達的作用及意義
　　目的：研究地塞米松對濕疹患者外周血 T細胞中RasGRP1表達的作用,篩

4、選產(chǎn)生作用的最適濃度,并探討地塞米松對 T細胞的影響及意義。
　　方法：選取臨床上使用地塞米松的重癥濕疹患者,抽取其地塞米松治療前及治療后的外周血,純化 T細胞。檢測地塞米松治療前后 T細胞內(nèi) RasGRP1的表達水平。在體外實驗中,將地塞米松配成三種不同濃度1×10-5mol/L、1×10-6mol/L及1×10-7mol/L,與未用激素治療的濕疹患者外周血 T細胞共同培養(yǎng),使用RT-PCR的方法檢測 T細胞內(nèi) RasGRP1的

5、mRNA水平,得出最適合的作用濃度。將此濃度的地塞米松作用于 T細胞,觀察不同時間點(0h、6h、12h、18h、24h)地塞米松對 T細胞內(nèi) RasGRP1表達的影響。使用MTT的方法檢測不同時間點、不同濃度的地塞米松作用于 T細胞時,對細胞凋亡的影響。
　　結果：未使用地塞米松治療時,濕疹患者 T細胞內(nèi) RasGRP1的表達高于正常人,使用地塞米松治療1周后,T細胞內(nèi) RasGRP1的表達明顯下降,接近正常人的表達水平。地塞米

6、松能抑制濕疹患者外周血 T細胞 RasGRP1的表達,在三種不同濃度的地塞米松中,1×10-5mol/L的濃度對 RasGRP1表達的抑制作用最明顯。使用濃度為1×10-5mol/L的地塞米松對濕疹患者外周 T細胞進行不同時間點的刺激,隨著時間的延長,地塞米松的抑制作用加強。24h時地塞米松對 T細胞內(nèi) RasGRP1的抑制作用最強。而不同濃度的地塞米松均能促進 T細胞的凋亡,這種作用呈時間依賴性。
　　結論：地塞米松能抑制濕疹患

7、者外周血 T細胞中RasGRP1的表達,并促進 T細胞的凋亡。這種抑制作用隨著地塞米松濃度的增加而增加,隨著時間的延長而加強。濕疹患者在臨床治療時,使用地塞米松治療1周后,外周血 T細胞內(nèi) RasGRP1的表達水平下降,接近正常人水平。這可能為激素的抗炎機制增加了新觀點。
　　第三部分 構建含有 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體及其對 T細胞的干擾效應
　　目的：以 RasGRP1為靶點,構建含有目的基因 H-Ra

8、sGRP1-shRNA的慢病毒載體,轉染 T細胞對其進行 RNA干擾,觀察轉染后 T細胞表達 RasGRP1的變化。研究基因沉默 RasGRP1后對 T細胞內(nèi) Ras下游信號通路蛋白的影響,以及對細胞凋亡和細胞因子分泌的影響,并探討其作用機制。
　　方法：構建含有目的基因 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,并檢測其生物學滴度。對 T細胞進行轉染,使用RT-PCR和Western Blot的方法檢測轉染后不同時間點(12h

9、、24h、48h、72h)T細胞內(nèi) RasGRP1的表達情況,并使用流式細胞儀檢測 T細胞的凋亡。使用12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(Phorbol12-myristate13-acetate,PMA)及離子霉素刺激 T細胞,觀察 T細胞內(nèi) Ras蛋白下游信號通路蛋白 p-Erk、Erk、Akt及p-Akt的表達。用ELISA的方法檢測 T細胞分泌細胞因子 IL-2、IL-4及IL-17的情況。使用慢病毒載體轉染 PMA及離子霉素刺激

10、后的T細胞,觀察轉染后 T細胞內(nèi) p-Erk、Erk、Akt及p-Akt蛋白表達的變化,以及T細胞分泌細胞因子的變化。
　　結果：成功構建 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學滴度達到1.0×108TU/ml,符合轉染要求。使用慢病毒載體轉染 T細胞后,T細胞內(nèi) RasGRP1的mRNA及蛋白水平下降,隨著時間的延長(12h、24h、48h、72h),RasGRP1的表達逐漸下降,72h時 RasGRP1的表達幾乎

11、消失。同時轉染后 T細胞的凋亡加快。使用PMA及離子霉素對 T細胞進行刺激,刺激前,濕疹患者和正常人 T細胞內(nèi)均有 p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表達,且濕疹患者的表達高于正常人。使用PMA及離子霉素刺激后,p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表達水平明顯增高,以濕疹患者增加的更為明顯。T細胞表達細胞因子 IL-2、IL-4及IL-17的水平明顯增加。用慢病毒載體轉染 PMA及離子霉素刺激后的T細胞,T細胞內(nèi) p-Erk及

12、p-Akt表達下降,而Erk及Akt的表達無明顯變化。T細胞的培養(yǎng)上清液中分泌的細胞因子 IL-2、IL-4及IL-17的表達水平下降。
　　結論：成功構建含目的基因 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學滴度能滿足轉染要求。慢病毒載體能成功轉染 T細胞,抑制T細胞內(nèi) RasGRP1的表達。RasGRP1基因沉默后,T細胞的凋亡增加。當濕疹發(fā)生時,T細胞受體活化后可能通過活化RasGRP1的表達,介導 Ras蛋白的下