RasGRP1在濕疹發(fā)病中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 RasGRP1在濕疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及T細(xì)胞中的表達(dá)及意義
　　目的：研究 RasGRP1在濕疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的表達(dá)。純化 PBMC中的T細(xì)胞,進(jìn)一步研究 RasGRP1在濕疹患者外周血T細(xì)胞中的表達(dá),并探討其意義。
　　方法：使用Ficoll法提取濕疹患者及正常人外周血中的PB

2、MC,采用免疫磁珠分選法從 PBMC中分選 T細(xì)胞,驗(yàn)證 T細(xì)胞的分選純度。使用RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)濕疹患者及正常人外周血 PBMC和T細(xì)胞中RasGRP1的表達(dá)。
　　結(jié)果：使用Ficoll法提取的外周血 PBMC的純度接近100％,而使用免疫磁珠分選法分選 T細(xì)胞,其純度能達(dá)到98％以上。在 PBMC中,濕疹患者 RasGRP1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯高于正常人,在純化后的T細(xì)胞中,濕疹患者

3、RasGRP1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平也明顯高于正常人。
　　結(jié)論：使用免疫磁珠分選外周血 PBMC中的T細(xì)胞純度較高。濕疹患者外周血 PBMC及T細(xì)胞中RasGRP1的表達(dá)水平較正常人均增高,提示 T細(xì)胞中RasGRP1的異常表達(dá)可能是濕疹發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)重要因素。
　　第二部分 地塞米松對(duì)濕疹患者 T細(xì)胞中RasGRP1表達(dá)的作用及意義
　　目的：研究地塞米松對(duì)濕疹患者外周血 T細(xì)胞中RasGRP1表達(dá)的作用,篩

4、選產(chǎn)生作用的最適濃度,并探討地塞米松對(duì) T細(xì)胞的影響及意義。
　　方法：選取臨床上使用地塞米松的重癥濕疹患者,抽取其地塞米松治療前及治療后的外周血,純化 T細(xì)胞。檢測(cè)地塞米松治療前后 T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的表達(dá)水平。在體外實(shí)驗(yàn)中,將地塞米松配成三種不同濃度1×10-5mol/L、1×10-6mol/L及1×10-7mol/L,與未用激素治療的濕疹患者外周血 T細(xì)胞共同培養(yǎng),使用RT-PCR的方法檢測(cè) T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的

5、mRNA水平,得出最適合的作用濃度。將此濃度的地塞米松作用于 T細(xì)胞,觀察不同時(shí)間點(diǎn)(0h、6h、12h、18h、24h)地塞米松對(duì) T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1表達(dá)的影響。使用MTT的方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度的地塞米松作用于 T細(xì)胞時(shí),對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：未使用地塞米松治療時(shí),濕疹患者 T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的表達(dá)高于正常人,使用地塞米松治療1周后,T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的表達(dá)明顯下降,接近正常人的表達(dá)水平。地塞米

6、松能抑制濕疹患者外周血 T細(xì)胞 RasGRP1的表達(dá),在三種不同濃度的地塞米松中,1×10-5mol/L的濃度對(duì) RasGRP1表達(dá)的抑制作用最明顯。使用濃度為1×10-5mol/L的地塞米松對(duì)濕疹患者外周 T細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的刺激,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),地塞米松的抑制作用加強(qiáng)。24h時(shí)地塞米松對(duì) T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的抑制作用最強(qiáng)。而不同濃度的地塞米松均能促進(jìn) T細(xì)胞的凋亡,這種作用呈時(shí)間依賴(lài)性。
　　結(jié)論：地塞米松能抑制濕疹患

7、者外周血 T細(xì)胞中RasGRP1的表達(dá),并促進(jìn) T細(xì)胞的凋亡。這種抑制作用隨著地塞米松濃度的增加而增加,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。濕疹患者在臨床治療時(shí),使用地塞米松治療1周后,外周血 T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的表達(dá)水平下降,接近正常人水平。這可能為激素的抗炎機(jī)制增加了新觀點(diǎn)。
　　第三部分 構(gòu)建含有 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體及其對(duì) T細(xì)胞的干擾效應(yīng)
　　目的：以 RasGRP1為靶點(diǎn),構(gòu)建含有目的基因 H-Ra

8、sGRP1-shRNA的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染 T細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行 RNA干擾,觀察轉(zhuǎn)染后 T細(xì)胞表達(dá) RasGRP1的變化。研究基因沉默 RasGRP1后對(duì) T細(xì)胞內(nèi) Ras下游信號(hào)通路蛋白的影響,以及對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子分泌的影響,并探討其作用機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建含有目的基因 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,并檢測(cè)其生物學(xué)滴度。對(duì) T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使用RT-PCR和Western Blot的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(12h

9、、24h、48h、72h)T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的表達(dá)情況,并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè) T細(xì)胞的凋亡。使用12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(Phorbol12-myristate13-acetate,PMA)及離子霉素刺激 T細(xì)胞,觀察 T細(xì)胞內(nèi) Ras蛋白下游信號(hào)通路蛋白 p-Erk、Erk、Akt及p-Akt的表達(dá)。用ELISA的方法檢測(cè) T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 IL-2、IL-4及IL-17的情況。使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染 PMA及離子霉素刺激

10、后的T細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染后 T細(xì)胞內(nèi) p-Erk、Erk、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)的變化,以及T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學(xué)滴度達(dá)到1.0×108TU/ml,符合轉(zhuǎn)染要求。使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染 T細(xì)胞后,T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的mRNA及蛋白水平下降,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(12h、24h、48h、72h),RasGRP1的表達(dá)逐漸下降,72h時(shí) RasGRP1的表達(dá)幾乎

11、消失。同時(shí)轉(zhuǎn)染后 T細(xì)胞的凋亡加快。使用PMA及離子霉素對(duì) T細(xì)胞進(jìn)行刺激,刺激前,濕疹患者和正常人 T細(xì)胞內(nèi)均有 p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表達(dá),且濕疹患者的表達(dá)高于正常人。使用PMA及離子霉素刺激后,p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表達(dá)水平明顯增高,以濕疹患者增加的更為明顯。T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子 IL-2、IL-4及IL-17的水平明顯增加。用慢病毒載體轉(zhuǎn)染 PMA及離子霉素刺激后的T細(xì)胞,T細(xì)胞內(nèi) p-Erk及

12、p-Akt表達(dá)下降,而Erk及Akt的表達(dá)無(wú)明顯變化。T細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分泌的細(xì)胞因子 IL-2、IL-4及IL-17的表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建含目的基因 H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學(xué)滴度能滿(mǎn)足轉(zhuǎn)染要求。慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染 T細(xì)胞,抑制T細(xì)胞內(nèi) RasGRP1的表達(dá)。RasGRP1基因沉默后,T細(xì)胞的凋亡增加。當(dāng)濕疹發(fā)生時(shí),T細(xì)胞受體活化后可能通過(guò)活化RasGRP1的表達(dá),介導(dǎo) Ras蛋白的下