調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞在Graves病發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在Graves病發(fā)病中的作用及機(jī)制研究
　?。ㄒ唬?Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的表型鑒定及數(shù)量分析
　　目的: 通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)確定Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞歸屬的亞群，比較Graves病患者和健康志愿者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群數(shù)量的差異;
　　方法: 本課題組自2011年2月至2011年11月在內(nèi)分泌科門(mén)診及病房入選Graves病初發(fā)患者15例、病情控制患者19例、健康志愿者36例。

2、收集受試者外周血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入CpG+PIB培養(yǎng)5小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+IL-10+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的百分含量;流式細(xì)胞分選儀分選CD19+B淋巴細(xì)胞，Real-Time PCR檢測(cè)并比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+B淋巴細(xì)胞的IL-10 mRNA表達(dá)水平的差異;比較IL-10+及IL-10-外周血單個(gè)核細(xì)胞各種分化抗原標(biāo)志(CD19、CD24、CD38、Ig

3、M、IgD、CD5、CD10、CD27、CD1d)銀光強(qiáng)度的差異，確定Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞歸屬的亞群，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較Graves病患者和健康志愿者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群百分含量的差異;
　　結(jié)果: Graves病初發(fā)患者外周血CD19+IL-10+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞百分含量及IL-10mRNA表達(dá)水平比病情控制患者和健康人明顯減少(P＜0.05);Graves病患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞亞

4、群屬于調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，Graves病初發(fā)患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞百分含量比病情控制患者和健康人明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論: Graves病患者外周血CD19+IL-10+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞亞群的百分含量較病情控制患者和健康人明顯減少，這表明調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在Graves病的發(fā)病中可能起到了一定作用。
　?。ǘ〨raves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的功能分析及機(jī)制研

5、究
　　目的: 比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞免疫抑制功能的差異，并探討其發(fā)揮免疫抑制作用的途徑;
　　方法: 本課題組自2011年7月至2011年12月在內(nèi)分泌科門(mén)診及病房入選初發(fā)患者6例、病情控制患者6例、健康自愿者6例。收集受試者外周血，分離純化的外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入CpG、CD40L和抗-CD3

6、共培養(yǎng)5天，最后6小時(shí)加入PIB，BrdU ELISA方法檢測(cè)Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+T細(xì)胞增殖水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+IFN-γ+和CD4+TNF-α+百分含量的差異;在共培養(yǎng)體系中加入IL-10抗體，探討IL-10在CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能中所起的作用;流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系中CD4+CD25hiCD127loFoxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含

7、量，探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在CD19ED24hiCD27+B細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能中所起的作用;
　　結(jié)果: 與健康志愿者比較，Graves病初發(fā)和病情控制患者CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌IL-10明顯減少(P＜0.05)，Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞亞群對(duì)CD4+T細(xì)胞增生和分泌IFN-γ、TNF-α的抑制作用明顯減弱(P＜0.05)。外周血中CD19+CD24hiCD27+

8、B細(xì)胞通過(guò)IL-10抑制CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，但不通過(guò)IL10抑制CD4+T細(xì)胞增生和CD4+T細(xì)胞分泌TNF-α;和健康志愿者比較，Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞亞群誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25hiCD127loFoxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量減少導(dǎo)致其免疫抑制功能下降。
　　結(jié)論: Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞免疫抑制功能較健康人

9、明顯減少，這表明調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在Graves病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到了一定作用。病情控制的患者CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞亞群的免疫抑制功能仍明顯低于正常人，這說(shuō)明目前臨床常用的藥物能使Graves病患者本身的免疫缺陷部分改善，但不能得以完全恢復(fù)。
　　第二部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在Graves病發(fā)病中的作用
　　目的: 通過(guò)對(duì)不同階段Graves病患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量以及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的測(cè)定

10、，研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在Graves病發(fā)病中的作用。
　　方法: 采集初發(fā)、病情控制的Graves病患者組以及健康人組等3組人群的外周血。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各淋巴細(xì)胞亞群的百分率，Real-Time PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞的Foxp3mRNA;免疫磁珠體外分離CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)其對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞的免疫抑制功能。
　　結(jié)果: 和健康人相比，Graves病初發(fā)患者外周血中的CD3+CD4+T和

11、CD3(-)CD19+B細(xì)胞均顯著增加（P＜0.05）;CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞則顯著減少（P＜0.05）;而病情控制患者各淋巴細(xì)胞亞群無(wú)明顯變化。Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD4+CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及Foxp3mRNA表達(dá)水平和健康人之間雖無(wú)明顯變化，但他們的免疫抑制功能明顯下降，其中初發(fā)患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能比病情控制患者明顯下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論: Grave