Id1在血管瘤發(fā)病中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、血管瘤是發(fā)生于嬰幼兒的最常見的良性腫瘤之一，主要由紊亂的血管和大量不成熟的內(nèi)皮細(xì)胞組成。發(fā)病率高達(dá)10～12％，嚴(yán)重影響患兒容貌、受累器官的功能、心理健康等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主張以積極的態(tài)度對(duì)該病進(jìn)行早期治療。但由于對(duì)其發(fā)病機(jī)制缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，致使治療效果整體上差強(qiáng)人意。
　　 Id（DNA結(jié)合抑制因子/分化抑制因子）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，它通過(guò)作用于多種信號(hào)傳導(dǎo)而抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)增生和轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞惡變和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.哺乳

2、動(dòng)物細(xì)胞含4種Id因子(Id1、Id2、Id3、Id4)，這些因子參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過(guò)程，包括細(xì)胞發(fā)育、成熟、生長(zhǎng)、分化和凋亡等，其中Id1與腫瘤發(fā)生的關(guān)系最為密切。Id1通過(guò)抑制細(xì)胞分化，推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制衰老、誘導(dǎo)侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　 鑒于Id1對(duì)于腫瘤中血管新生方面的突出作用，筆者將目光鎖定在以大量紊亂的血管及不成熟內(nèi)皮細(xì)胞為主要標(biāo)志的的血管瘤上面。通過(guò)臨床標(biāo)本上檢測(cè)Id1

3、在血管瘤中的表達(dá)情況，并對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾，以研究Id1在血管瘤發(fā)病中的作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 材料與方法:
　　 第一部分:用免疫組化分別檢測(cè)12例增生期血管瘤、10例消退期血管瘤、9例血管畸形、7例淋巴管畸形組織及4例動(dòng)靜脈畸形中的Id1的表達(dá)。將增生期血管瘤組織及瘤周正常皮膚組織分別用Trizol裂解液提取總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用Id1引物進(jìn)行(Real-timeflu

4、orescencequantitativePCR，RFQ-PCR)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)兩種組織中Id1基因的mRNA表達(dá)情況，再取增生期血管瘤組織及瘤周正常皮膚組織，常規(guī)提取總蛋白，一抗二抗孵育，進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)兩種組織中的蛋白表達(dá)情況。
　　 第二部分:用組織塊培養(yǎng)的方法培養(yǎng)增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，用設(shè)計(jì)好的Id1干擾慢病毒(Id1-RNAi-lentivirus)及空載體慢病毒(Id1-NC-le

5、ntivirus)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用熒光觀測(cè)、RFQ-PCR、Westernblot確認(rèn)干擾成功，用MTT比色法描記干擾前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化、用TUNEL檢測(cè)干擾前后細(xì)胞凋亡的改變，用WESTERNblot及PCR檢測(cè)干擾前后HIF-1α水平的改變，用免疫組化的方法定性檢測(cè)干擾前后iNOS表達(dá)的改變;用ELISA檢測(cè)干擾前后VEGF的改變。用Tubeformation觀測(cè)干擾前后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的改變。
　　 結(jié)果:

6、>　　 第一部分:免疫組化結(jié)果顯示增生期血管瘤組織中Id1表達(dá)整體呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率高達(dá)90.3％;消退期血管瘤Id1表達(dá)整體呈弱陽(yáng)性趨勢(shì)，陽(yáng)性率53％;血管畸形、淋巴管畸形及動(dòng)靜脈畸形整體陽(yáng)性率較弱，依次為52％、57％、53.7％。RFQ-PCR顯示增生期血管瘤組織中Id1的mRNA水平明顯高于瘤周正常皮膚組織。Westernblot顯示增生期血管瘤組織中Id1的蛋白表達(dá)水平明顯高于瘤周正常皮膚組織。
　　 第二部分:實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果顯示熒光觀測(cè)、RFQ-PCR、Westernblot確認(rèn)干擾成功。MTT比色法描記的干擾前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示:干擾后hemECs增殖能力下降，與未干擾組有顯著差異。TUNEL檢測(cè)干擾前后細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:干擾后hemEC凋亡明顯增多，與未干擾組有顯著差異。RFQ-PCR及WESTERNblot檢測(cè)干擾前后HIF-1α含量變化顯示:干擾后HIF-1αRNA水平并無(wú)明顯降低，但蛋白含量減少，與未干擾組有明顯差異。免疫組化的方法定性檢測(cè)

8、干擾前后iNOS表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)干擾后iNOS整體陽(yáng)性率下降，陽(yáng)性強(qiáng)度變?nèi)?。ELISA檢測(cè)干擾前后VEGF的改變，結(jié)果顯示，干擾后VEGF的含量減少，與對(duì)照組有明顯差異。Tubeformation觀測(cè)干擾前后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的改變，結(jié)果顯示干擾后成管能力下降，且成管持續(xù)時(shí)間減少，管壁消退快，與對(duì)照組相比有明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分:實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Id1在淋巴管畸形、靜脈畸形、動(dòng)靜脈畸形僅在有管腔結(jié)構(gòu)的

9、部位表達(dá)，其余部分不表達(dá)或低表達(dá)，Id1在增生期血管瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在消退期血管瘤中低表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度隨消退成分的多少而改變。增生期血管瘤中Id1的表達(dá)在RNA水平及蛋白水平均高于瘤周正常皮膚組織，提示Id1在血管瘤發(fā)病中或起重要的作用。
　　 第二部分:結(jié)果顯示沉默Id1后，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及成血管能力降低，但凋亡增多。而其下游分子HIF-1α、VEGF、iNOS的含量降低，提示干擾Id1之后，導(dǎo)致通路上的因子含量發(fā)生