Id1參與胃癌血管生成的作用及可能機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生與維持離不開新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞的侵襲更依賴于腫瘤內(nèi)新生血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。尋找一個(gè)合適新生血管的靶標(biāo)，是治療腫瘤的關(guān)鍵。目前認(rèn)為分化抑制因子1（Id1）是一種準(zhǔn)原癌基因的侯選分子和促血管生成因子，多項(xiàng)研究提示其表達(dá)在腫瘤的血管生成過程中可能起著重要作用。 Id 是螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）轉(zhuǎn)錄因子亞家族的一個(gè)成員，通過影響其下游分子的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用，但其參與血管生成的具體機(jī)制尚不明確。 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs

2、）是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜重塑所必需的條件，目前認(rèn)為MMPs 并不僅僅只降解ECM 成分，其更多的是作用于血管的發(fā)生。MMPs 幾乎在所有的人類腫瘤中廣泛而大量表達(dá)，大量研究證實(shí)MMPs 的高水平表達(dá)與腫瘤的侵襲和/或轉(zhuǎn)移能力以及不良預(yù)后有關(guān)，并在腫瘤的血管生成中起著決定性作用。有報(bào)道提出，在Id1 基因敲除的鼠胚胎纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)上清中MMP-2 的活性下降。本研究著重探討了Id1 通過調(diào)控MMPs 發(fā)揮促胃癌血管生成的作用。

3、 環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，激發(fā)血管生成是其促癌機(jī)制之一，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。我實(shí)驗(yàn)室的前期工作提示，COX-2 抑制劑可以下調(diào)Id1 的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步研究了COX-2 對(duì)Id1 在胃癌血管生成作用中的調(diào)控。 [目的] （1）研究Id1 與MMPs 在胃癌血管生成中的關(guān)系及相互作用； （2）探討在胃癌血管生成中COX-2 對(duì)I

4、d1 的調(diào)控。 [方法] （一）Id1 通過調(diào)控MMPs 發(fā)揮促胃癌血管生成的作用： （1）采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Id1 及MMP-2、-9 在胃癌組織中的表達(dá)； （2）采用RT-PCR 和Western blot 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Id1 特異性小干擾RNA（Id1-siRNA）的SGC7901 細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，并用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)Id1-siRNA 細(xì)胞中MMP-2、-9 的

5、活性；（3）采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Id1-siRNA 細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤組織中MMP-2、-9 的表達(dá)； （4）利用MMPs ELISA 試劑盒檢測(cè)不同處理組細(xì)胞上清中MMP-2、-9 的含量； （5）收集外源性高表達(dá)Id1 的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清，作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），利用Transwell 小室觀察內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力和管狀形成的情況，再加入MMP-2、-9 的中和性抗體，觀察

6、其對(duì)上述變化的影響； （6）利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)在胃癌細(xì)胞中抑制Id1 后，MMP-2、-9 啟動(dòng)子活性的變化。 （二）COX-2 對(duì)Id1 在胃癌血管生成作用中的調(diào)控： （1）建立高表達(dá)COX-2 和表達(dá)COX-2 特異性siRNA 的胃癌SGC7901 細(xì)胞系； （2）通過Western blot 和RT-PCR 方法檢測(cè)兩種亞細(xì)胞系中Id1 的表達(dá)； （3）采用ELISA 方法分析

7、兩種細(xì)胞上清中VEGF 的表達(dá)差異； （4）通過MTT 實(shí)驗(yàn)分析兩種細(xì)胞亞系的上清對(duì)HUVECs 體外增殖的影響，并在SGC7901/COX-2 中抑制Id1 后觀察培養(yǎng)上清中VEGF 的變化以及對(duì)HUVECs增殖的影響； （5）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察SGC7901/COX-2/Id1-siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的成瘤性、腫瘤新生微血管密度（MVD）及Id1 的表達(dá)。 [結(jié)果] （1）免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在胃癌組織

8、中Id1 和MMP-2、9 呈共表達(dá)； （2）成功建立表達(dá)特異性Id1-siRNA細(xì)胞系，Western blot和RT-PCR結(jié)果提示不同克隆的轉(zhuǎn)染效率不同； （3）轉(zhuǎn)染Id1-siRNA的SGC7901 細(xì)胞中MMP-2、-9 的蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組； （4）明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示，Id1-siRNA細(xì)胞組的MMP-2、-9 的活性較對(duì)照細(xì)胞組下降； （5）Id1– siRNA細(xì)胞處理后的裸鼠

9、體內(nèi)成瘤組織中MMP-2、-9 的表達(dá)均顯著降低； （6）在SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，HUVECs管狀形成和增殖能力明顯降低，在其中加入MMP-2、-9 的中和性抗體后抑制作用被逆轉(zhuǎn)； （7）根據(jù)生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://dbtss.hgc.jp/)提供的啟動(dòng)子序列（-2000~+200），我們克隆了MMP-2、-9 的啟動(dòng)子并構(gòu)建入PGL-3basic報(bào)告基因載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)

10、胞和Id1 表達(dá)降低的SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞?？梢詸z測(cè)出在Id1 表達(dá)降低的細(xì)胞中，MMP-2、-9 的轉(zhuǎn)錄活性均降低了2~2.5 倍； （8）成功建立高表達(dá)COX-2 以及表達(dá)特異性COX-2-siRNA的穩(wěn)定克隆，并鑒定了不同克隆的轉(zhuǎn)染效率； （9）高表達(dá)COX-2 的胃癌SGC7901 細(xì)胞中Id1 的蛋白及mRNA表達(dá)水平增高，而轉(zhuǎn)染COX-2-siRNA的SGC7901 細(xì)胞中Id1 的表達(dá)則均

11、低于對(duì)照組； （10）COX-2 高表達(dá)的SGC7901/COX-2 細(xì)胞上清中VEGF的蛋白含量較對(duì)照組高，而SGC7901/COX-2-siRNA細(xì)胞上清中VEGF的蛋白含量較對(duì)照組低； （11）在SGC7901/COX-2 細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，HUVECs生長(zhǎng)較對(duì)照組加快； 在SGC7901/COX-2-siRNA細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，HUVECs生長(zhǎng)較對(duì)照組減慢； （12）在SGC7901/COX-2

12、中抑制Id1 后，培養(yǎng)上清中VEGF的含量下降，且對(duì)HUVECs促進(jìn)增殖的作用被逆轉(zhuǎn)；（13）裸鼠成瘤試驗(yàn)顯示抑制Id1 后SGC7901/COX-2 細(xì)胞成瘤性降低，成瘤組織的微血管密度下降，Id1 的表達(dá)也下調(diào)。 [結(jié)論] （1）Id1 和MMP-2、MMP-9 在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)； （2）Id1 可正性調(diào)控MMP-2、-9 的表達(dá)水平，抑制Id1 的表達(dá)可減弱MMP-2、-9 的表達(dá)； （3）Id

13、1 通過對(duì)MMP-2、-9 的正性調(diào)控促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖、遷移和管狀形成的能力，并通過激活錄促進(jìn)MMP-2、-9 的表達(dá)和活性； （4）COX-2可上調(diào)SGC7901 細(xì)胞中Id1 的表達(dá)，并通過此途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖能力。 本研究提示，在胃癌發(fā)生發(fā)展中Id1 可能通過調(diào)控MMP-2、-9 的表達(dá)及活性促進(jìn)血管生成，并且在胃癌中高表達(dá)的COX-2 可能參與調(diào)控了Id1 介導(dǎo)的促血管生成作用，因此Id1 有可能成為