分化抑制因子1(Id1)在胃癌發(fā)生和進展中的作用及機制研究.pdf

1、胃癌是世界范圍尤其是亞洲地區(qū)較為常見的腫瘤。胃癌的發(fā)病機制目前尚不完全明確，而Id1 在胃癌中的表達情況和作用未見報道。在本課題研究中，我們關注Id1 分子在胃癌發(fā)生和進展中的作用，并初步探討其機制，對胃癌腫瘤的發(fā)病機理的研究將有所幫助。 【目的】 1、研究Id1 在胃腺癌中的表達以及與臨床病理特征和臨床分期的關系，探討其在胃癌發(fā)生和進展中的意義；2、觀察Id1 對胃癌細胞惡性表型的影響并探討可能的機制，篩選Id1 的下

2、游效應分子；3、研究胃癌細胞中低氧條件或HIF-1 過表達時，Id1 的表達變化及調(diào)控機制。 【方法】 1、應用免疫組化觀察Id1 在胃腺癌組織中的表達；2、應用半定量RT-PCR方法和Western blot 技術，檢測Id1 蛋白在胃癌細胞系及組織中的表達以及Id1，Id2 和Id3 在胃癌細胞系中mRNA 水平的表達情況；3、通過基因重組方法構建Id 的全長載體、siRNA 載體；4、應用MTT 實驗、平板克隆、軟

3、瓊脂克隆形成實驗以及裸鼠體內(nèi)成瘤實驗研究Id1 對胃粘膜永生化上皮細胞GES-1 體外增殖及體內(nèi)成瘤性的影響；5、應用MTT 實驗，流式細胞儀、細胞侵襲實驗、裸鼠移植瘤實驗，研究Id1 對胃癌細胞SGC7901 生長、凋亡、侵襲和體內(nèi)成瘤能力的影響；6、通過內(nèi)皮細胞體外增殖、管形成和體內(nèi)腫瘤微血管染色等實驗研究Id1 的表達變化對內(nèi)皮細胞的影響和體內(nèi)新生血管密度的影響；7、ELISA 方法用于檢測培養(yǎng)細胞上清中VEGF 的含量；8、通過

4、基因芯片技術篩選Id1 相關的差異表達基因，并應用Western blot 檢測轉染細胞系中部分下游分子如：p16、p21、TIMP4 的表達水平；9、在低氧培養(yǎng)條件下（1％O2）觀察SGC7901 細胞中Id1 的表達變化；10、應用雙熒光素酶報告基因實驗，檢測在低氧條件下以及共轉染HIF-1 時，Id1 啟動子活性的變化；11、應用體外凝膠遷移（EMSA）和體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗，鑒定HIF-1 結合Id1 啟動子的片

5、斷。 【結果】 1、Id1 在胃腺癌組織中表達升高 我們應用Western blot技術檢測Id1的表達，發(fā)現(xiàn)在11例(11/15)胃腺癌手術組織標本中，與其相應的癌旁組織相比，Id1在蛋白水平的表達明顯增高；應用免疫組化技術檢測Id1在99例胃腺癌病人手術標本石蠟切片中的表達，發(fā)現(xiàn)Id1主要表達于胃癌細胞的胞漿，僅少數(shù)表達于胞核。在正常胃粘膜上皮幾乎沒有表達，在10-30％腸化生伴有異型增生的細胞中有表達，染色

6、評分為0.33±0.09；進一步分析Id1的表達與胃癌臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)Id1在低分化胃腺癌（染色評分：1.4±0.45）明顯強于高分化胃腺癌中的表達（染色評分：0.66±0.12，p<0.05）。Id1在TNMⅢ期和Ⅳ期患者的胃腺癌組織中的染色明顯強于在Ⅰ期和Ⅱ期組織中的表達（p<0.05），染色評分分別為1.31±0.87和0.66±0.52。此結果提示，與癌旁胃粘膜上皮組織相比，胃腺癌組織中Id1的表達增高，且在低分化和TN

7、M晚期的患者中表達更高。 應用半定量RT-PCR和Western blot的方法，檢測胃癌細胞SGC7901, AGS,MGC803, MKN45, MKN28, KATOⅢ及胃粘膜上皮永生化細胞系GES-中Id1，Id2和Id3三個基因mRNA的表達情況以及Id1蛋白水平的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)：與正常胃粘膜組織相比，胃上皮永生化細胞系GES-1及七種胃癌細胞系中Id1，Id2和Id3在mRNA水平表達增高；Id1蛋白在七種細胞系

8、中的表達也增高，且在低分化的細胞系中升高更為顯著。 2、Id1 外源性高表達于永生化胃粘膜上皮細胞可以促進其增殖，Id1 的特異性小干擾RNA 可以降低胃癌細胞的惡性表型 我們構建了Id1 的全長表達載體，穩(wěn)定轉染了永生化胃粘膜上皮細胞GES-1，發(fā)現(xiàn)Id1 的高表達能夠明顯促進GES-1 在體外的增殖，并賦予其在軟瓊脂中生長和形成克隆的能力。 我們將構建好的siRNA 載體，穩(wěn)定轉染了Id1 中等程度表達的胃癌S

9、GC7901 細胞，該siRNA 能顯著抑制SGC7901 中Id1 的表達（IdRNAi1 和IdRNAi2 克隆中Id1 的抑制率分別為60％和90％）。Id1RNAi 轉染導致：SGC7901 細胞體外增殖減慢，在平板和軟瓊脂上形成克隆的能力降低，裸鼠體內(nèi)成瘤性也降低，瘤體積明顯減小，生長減緩；流式細胞儀檢測顯示細胞阻滯于G1 期；Id1RNAi 的瞬時轉染能夠使細胞凋亡增加，Hochest33258 和TUNEL 原位檢測成瘤組

10、織中凋亡細胞增多，細胞中Casepase3 的活性形式增加；細胞穿過附著基質(zhì)模仿物Matrigel 的Transwell 小室的能力下降；細胞培養(yǎng)上清中分泌型VEGF 的含量明顯降低，且該細胞的條件培養(yǎng)基能抑制HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細胞）的生長和體外管狀形成，在裸鼠體內(nèi)成瘤組織中微血管密度也明顯下降。上述Id1RNAi 對胃癌細胞惡性表型的改變與Id1在細胞中的表達呈劑量依賴關系。上述結果提示，Id1 參與了胃癌細胞的增殖、侵襲、凋亡

11、及誘導血管生成等多種生物學行為的變化，且Id1 的表達水平反映了細胞的惡性程度。 經(jīng)過Trizol 法抽提SGC7901-Id1RNAi 和對照細胞的總RNA，通過瓊脂糖檢測和Lab-on-Chip 分析表明，所提取的RNA 無明顯降解，RNA 的質(zhì)和量符合基因芯片測定的要求。經(jīng)過RNA 純化、熒光探針的制備純化及定量、芯片雜交、圖像采集及數(shù)據(jù)標準化等步驟，發(fā)現(xiàn)芯片的雜交信號強度較高，片內(nèi)信號均一。以兩種細胞信號強度的比值小于0

12、.5 或者大于2 為標準判定差異表達基因，結果發(fā)現(xiàn)，與對照細胞相比，SGC7901/Id1RNAi 細胞中上調(diào)表達的基因有1551 個，下調(diào)表達的基因有70 個。我們對其中的差異分子進行檢測，發(fā)現(xiàn)在SGC7901-Id1RNAi 細胞中p16, p21 的表達被上調(diào)，TIMP4的表達上調(diào)，提示這些分子可能是Id1 發(fā)揮作用的下游分子。 3、在低氧條件下HIF-1 與Id1 啟動子5’端-924 位點結合并促進Id1 在胃癌細胞中

13、的表達 我們觀察到，在低氧條件下Id1mRNA 和蛋白水平表達均增加，而這種變化在HIF-1 被抑制后消失。提示Id1 可能是一個低氧反應并能被HIF-1 誘導的基因。根據(jù)生物信息學預測(http://dbtss.hgc.jp/)，Id1 啟動子區(qū)域（-3000~+100）含有8 個HBS（HIF-1 Binding Site），并且第6（-924）和7（-910）個HBS 都緊鄰有CACAG 序列，這個序列對于HIF 與HBS

14、 的結合具有重要的輔助功能。我們克隆了不同長度的Id1 啟動子（分別命名為PM 和PS），PM 包含了第6，7 和8 個潛在HBS，PS 僅包含第8 個HBS。將PM 和PS克隆入PGL-3 basic 報告基因載體，瞬時轉染SGC7901 細胞。在低氧（1％O2）誘導或共轉染HIF-1 質(zhì)粒時，可以檢測到PM 的轉錄活性增強。我們針對這些潛在的HBS 位點設計了探針和引物，應用體外EMSA（Electrophoresismobilit

15、y shift assay）和體內(nèi)ChIP（chromosome immunoprecipitation）檢測轉錄因子與DNA 結合的方法，檢測這些潛在的HBS 與HIF-1 的結合。結果發(fā)現(xiàn)HIF-1 能夠結合于第6 個（5’端-924 位點）HBS，突變探針中的3 個核苷酸（CGT），這種結合能力則喪失。本實驗提示，HIF-1 能與Id1 的啟動子結合，在-3000~+100 啟動子范圍內(nèi)，5’端-924 位點處的HBS（5’-GA