分化抑制因子—Id2在成肌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)C<,2>C<,12>成肌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以外源性活性氧刺激?xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與凋亡，摸索出誘導(dǎo)C<,2>C<,12>細(xì)胞增殖與凋亡的最佳作用條件。觀察細(xì)胞增殖與凋亡中的Id2表達(dá)，探討氧化應(yīng)激與Id2的相互作用關(guān)系；利用H<,2>O<,2>、LPS、馬血清誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡與分化，觀察Id2在細(xì)胞生長(zhǎng)各階段的表達(dá)，以探討Id2在C<,2>C<,12>成肌細(xì)胞增殖、凋亡與分化中的作用，為以后Id2與骨骼肌再

2、生研究提供實(shí)驗(yàn)參考。 【目的】 探討C<,2>C<,12>細(xì)胞在增殖、分化與凋亡過(guò)程中Id2的表達(dá)情況。 【方法】 1、利用RT-PCR的方法擴(kuò)增出Id2全長(zhǎng)cDNA，利用T4DNA連接酶將載體pGEM-T和Id2 cDNA進(jìn)行連接，構(gòu)建克隆載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcORI酶切pGEM-Id2克隆載體和pEGFP-C2真核表達(dá)載體，構(gòu)建出重組真核表達(dá)載體pEGFP-C2-Id2，經(jīng)酶切分析、PCR鑒定及DN

3、A測(cè)序證實(shí)cDNA片段大小和序列的正確性。 2、過(guò)氧化氫誘導(dǎo)C<,2>C<,12>細(xì)胞增殖與凋亡，MTT和Hoechst33342/PI雙染篩選出誘導(dǎo)增殖和凋亡的作用條件；在此基礎(chǔ)上，免疫熒光法檢測(cè)Id2在增殖與凋亡細(xì)胞中的表達(dá)。 3、H<,2>o<,2>、LPS、馬血清誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡與分化，觀察Id2的表達(dá)情況。 【結(jié)果】 1、成功構(gòu)建pEGFP-C2-Id2真核表達(dá)載體；成功轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-

4、Id2真核表達(dá)載體入C<,2>C<,12>細(xì)胞中。 2、過(guò)氧化氫誘導(dǎo)C<,2>C<,12>細(xì)胞增殖與凋亡的作用條件分別為：25μmol/L，48h：50μol/L，48h。Id2在增殖和凋亡的C<,2細(xì)胞中均有表達(dá)：相對(duì)正常組，25μol/LH<,2>O<,2>組最強(qiáng)，其次為50μol/L H<,2>o<,2>組，且隨H<,2>O<,2>濃度增加而表達(dá)增強(qiáng)。 3、H<,2>O<,2>、LPS、馬血清處理細(xì)胞

5、48h后：2％馬血清組，Id2未見(jiàn)表達(dá)；25μol/LH<,2>O<,2>誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖中Id2表達(dá)最強(qiáng)；50μol/L H<,2>O<,2>誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Id2也大量表達(dá)；LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中隨其濃度增加Id2表達(dá)增強(qiáng)。 【結(jié)論】 1、低濃度(25μol/L)H<,2>o<,2>可促進(jìn)C<,2>C<,12>細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)工d2的表達(dá)；高濃度(50μol/L以上)H<,2>o<,2>可促進(jìn)C<,2>C<,12>細(xì)