IRE-1-JKD通路在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:功能矯形，是矯治處于生長(zhǎng)發(fā)育期中的青少年和兒童錯(cuò)合畸形的一種重要的手段。功能矯治器通過(guò)咬合重建引發(fā)一系列的神經(jīng)肌肉收縮力的變化，該力傳遞到口腔周圍的軟硬組織，促進(jìn)軟硬組織的適應(yīng)性變化，刺激頜骨和牙周組織的生長(zhǎng)改建，改變頜骨的自然生長(zhǎng)潛力，從而達(dá)到錯(cuò)合畸形的目的。只有面頜部肌肉改建與口腔周圍軟硬組織相協(xié)調(diào)，功能矯形的效果才能穩(wěn)定，因此，探討面頜部肌肉適應(yīng)性改建機(jī)制對(duì)于闡明功能矯形的原理具有指導(dǎo)意義。研究面頜部肌肉組織的適應(yīng)性改建的機(jī)

2、制，須從細(xì)胞入手。成肌細(xì)胞是肌肉組織的干細(xì)胞，成肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為在面頜部肌肉的適應(yīng)性改建中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而成肌細(xì)胞的凋亡是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡的途徑有兩條:包括外源性的死亡活化受體途徑和內(nèi)源性的線粒體損傷途徑，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是近年來(lái)逐漸被人們揭示的一條新的凋亡途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的狀態(tài)，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

3、，真核細(xì)胞激活一些列自身保護(hù)機(jī)制，稱為未折疊蛋白反應(yīng);但持續(xù)的或者過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究建立在成功構(gòu)建成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)力學(xué)刺激模型的基礎(chǔ)上，旨在探索周期性應(yīng)力引起成肌細(xì)胞凋亡的規(guī)律，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE-1-JNK信號(hào)通路在該過(guò)程中的作用及其機(jī)制;從而獲得應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞凋亡的信息，為功能矯形治療中合理使用應(yīng)力以及闡明面頜部肌肉的適應(yīng)性改建的機(jī)理提供的理論依據(jù)。
　　方法:體外培養(yǎng)L6大鼠成肌細(xì)胞，應(yīng)用多通道

4、應(yīng)力加載裝置對(duì)分別對(duì)成肌細(xì)胞加載0h、1h、2h、6h、12h和24h的周期性張應(yīng)力(頻率為10 cycles/min，拉伸變形率為15％)，構(gòu)建成肌細(xì)胞-體外培養(yǎng)力學(xué)刺激模型，對(duì)照組為不加力組(0h)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組其他培養(yǎng)條件相同。應(yīng)用Hochest33258染色觀察不同應(yīng)力加載時(shí)間對(duì)成肌細(xì)胞凋亡的影響;應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成肌細(xì)胞的凋亡率;采用Real Time PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子Chop、

5、TRAF2、ASK1和JNK mRNA的表達(dá)變化;應(yīng)用Western blotting檢測(cè)JNK蛋白的表達(dá)變化;加入IRE-1特異性抑制劑STF-083010后檢測(cè)TRAF2、ASK1和JNK mRNA和JNK蛋白的表達(dá)變化，以明確IRE-1-JNK通路在應(yīng)力介導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制，采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、Hochest33258染色、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢

6、測(cè)成肌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果一致表明周期性張應(yīng)力（頻率為10 cycles/min，拉伸變形率為15％）可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且凋亡率隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)而呈一致上升趨勢(shì)，且在24h達(dá)峰值。
　　2、Real Time PCR結(jié)果顯示:CHOP、TRAF2、ASKl mRNA表達(dá)量隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，并在24h達(dá)最高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); JNK mRNA的表達(dá)量在0～2h逐漸上升后逐漸下降，隨

7、后又逐漸上升在24h達(dá)最高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、Western blotting結(jié)果顯示:JNK蛋白隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，先升高，其后略有下降，并于24h達(dá)到最高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、加入大鼠IRE-1特異性抑制劑STF-083010后，Real Time PCR檢測(cè)TRAF2、ASK1JNK mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示:TRAF2、ASK1表達(dá)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、(P＜0.05)，與對(duì)照組（0h不加抑制劑組）表達(dá)量的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;JNK表達(dá)量與不加抑制劑組明顯降低，但仍高于對(duì)照組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、加入抑制劑后，Western blotting檢測(cè)JNK蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，JNK蛋白表達(dá)量與不加抑制劑組比較其表達(dá)量明顯降低，但仍高于對(duì)照組（0h不加抑制劑組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是加抑制劑后各組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、周期性張應(yīng)力（頻率為10 cycles/min，拉伸變形率為15％）可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的凋亡，并且隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。
　　2、CHOP、TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白的表達(dá)量升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑參與了應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞的凋亡。
　　3、加入IRE-1抑制劑后，TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白表達(dá)量均