DDAH在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞分化及介導(dǎo)藥物抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide,NO)合酶(nitric oxide synthase,NOS)/NO與神經(jīng)細(xì)胞分化密切相關(guān)。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)能特異性水解內(nèi)源性NOS抑制物非對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA),上調(diào)NOS活性。DDAH廣泛存在于各種細(xì)胞和心血管、神經(jīng)系統(tǒng)組織中。目前認(rèn)為

2、其活性降低所致的ADMA代謝減少與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是一個(gè)新的心血管疾病相關(guān)蛋白和藥物防治靶點(diǎn)。新近研究發(fā)現(xiàn),舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后DDAHmRNA的水平明顯升高,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)可顯著降低神經(jīng)細(xì)胞DDAH的表達(dá)和活性并增加ADMA的水平,提示DDAH可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育或某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　本論文將從分子細(xì)胞水平系統(tǒng)研究DDAH在神經(jīng)細(xì)胞分化和凋亡中的作用,并探討D

3、DAH/ADMA通路是否介導(dǎo)3,4,5,6-四羥基(口山)酮和全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)的抗凋亡作用。
　　主要研究工作如下:在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerver growth factor,NGF)誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞分化的體外模型,利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默或過(guò)表達(dá)DDAH1基因,系統(tǒng)探討DDAH1調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞分化的作用及分子機(jī)制。結(jié)果顯示:NGF(50 ng/ml)能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化,增加NO

4、水平、DDAH1、nNOS mRNA及蛋白表達(dá),并呈時(shí)間依賴性;NGF降低DDAH2mRNA和蛋白表達(dá);NGF對(duì)DDAH活性和ADMA水平無(wú)明顯影響;L-NAME能抑制NGF誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化和NO水平,但不影響DDAH1及DDAH2的表達(dá)。沉默DDAH1可抑制NGF誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化及其標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白(microtubule-associatedprotein2,MAP2)的表達(dá),同時(shí)抑制nNOS mRNA的表達(dá);而過(guò)表達(dá)DD

5、AH1誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化,增加G0/G1期細(xì)胞百分比,增加nNOSmRNA的表達(dá),L-NAME能抑制過(guò)表達(dá)DDAH1誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化。
　　(口山)酮是普遍存在于植物中的一類(lèi)多酚類(lèi)化合物。具有強(qiáng)效的抗氧化、抗炎作用。某些(口山)酮單體對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用與升高DDAH活性從而降低內(nèi)源性ADMA水平有關(guān)。3,4,5,6-四羥基(口山)酮是我校藥學(xué)院藥物化學(xué)系合成的新型(口山)酮單體化合物。我室前期工已證明,3,4,5,6-四羥基

6、(口山)酮對(duì)缺血心肌及血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用,其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)?；贏β所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激密切相關(guān)及3,4,5,6-四羥基(口山)酮具有抗氧化特性,本實(shí)驗(yàn)采用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷建立阿爾茨海默病(Alzheimers disease,AD)的細(xì)胞模型,研究3,4,5,6-四羥基(口山)酮對(duì)Aβ25-35所致PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,并探討其機(jī)制是否與DDAH/ADMA途徑有關(guān)。結(jié)果顯示:10μM Aβ2

7、5-35與PC12神經(jīng)細(xì)胞孵育48 h能顯著增加細(xì)胞凋亡率;Aβ25-35處理PC12細(xì)胞3 h后逐漸增加ROS水平和caspase-3活性,抗氧化劑PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制劑DEVD-CHO(100μM)能顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的凋亡;(口山)酮(3,10或30μM)能顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,ROS水平和caspase-3活性的增加。Aβ25-35處理PC12神經(jīng)細(xì)胞6 h后能顯著降低DDAH活

8、性和增加ADMA水平,(口山)酮(3,10或30μM)能顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的上述作用。ADMA濃度和時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;ADMA(10μM)處理PC12細(xì)胞3 h后逐漸增加ROS水平和caspase-3活性,抗氧化劑PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制劑DEVD-CHO(100μM)能顯著抑制ADMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　atRA在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用。atRA通過(guò)與維甲酸受體(r

9、etinoic acid receptor,RAR)和維甲類(lèi)受體(retinoid X receptor,RXR)結(jié)合,從而啟動(dòng)一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄。其中DDAH2的啟動(dòng)子區(qū)含有維甲酸反應(yīng)元件。新近研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞atRA能上調(diào)DDAH2的表達(dá)。本研究將探討CoCl2誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡是否涉及DDAH/ADMA通路及atRA是否通過(guò)上調(diào)DDAH2表達(dá)抑制CoCl2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示:125μM CoCl2與PC

10、12神經(jīng)細(xì)胞孵育48 h能顯著增加細(xì)胞凋亡率;CoCl2處理PC12細(xì)胞3 h后逐漸增加ROS水平和caspase-3活性;atRA(0.1,1 or 10μM)能顯著抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、ROS水平與caspase-3的活性的增加;抗氧化劑PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制劑DEVD-CHO(100μM)能顯著抑制CoCl2誘導(dǎo)的凋亡。CoCl2處理PC12神經(jīng)細(xì)胞6 h后能顯著降低DDAH活性和增加ADMA水平;