Cirbp在低氧誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　青藏高原地處我國西南邊境，面積約占我國國土面積的16％，平均海拔高度在4000米以上，其在國家經(jīng)濟(jì)建設(shè)和國防戰(zhàn)略部署上具有重要的意義。人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是大腦對低氧十分敏感。低氧是導(dǎo)致機(jī)體在高海拔地區(qū)暴露出現(xiàn)不適反應(yīng)的主要原因，但其引起相關(guān)癥狀的具體機(jī)制和干預(yù)方法尚待闡明。
　　目前研究認(rèn)為，急、慢性低氧暴露均可引起神經(jīng)細(xì)胞尤其是神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞為了適應(yīng)低氧，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝及低氧相關(guān)基因的表達(dá)來維持細(xì)胞穩(wěn)

2、態(tài)，包括不同類型的細(xì)胞增殖、分化、生長抑制或凋亡相關(guān)分子。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor,HIF）是普遍存在于人和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的、在低氧條件下穩(wěn)定性顯著升高的一類具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白。HIF與低氧細(xì)胞應(yīng)答具有密不可分的聯(lián)系，并在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷/存活的過程中起到了至關(guān)重要的作用。冷誘導(dǎo) RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA-binding protein,Cirbp）是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白。

3、在哺乳動物包括人類細(xì)胞中，Cirbp常伴隨冷刺激、缺氧應(yīng)激、紫外線照射等過程過量表達(dá)。低氧刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞中的Cirbp由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，減輕低氧引起的細(xì)胞凋亡水平。miRNAs家族也參與缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，miRNAs參與了多項(xiàng)生物過程的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，在凋亡基因和抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控方面起重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，Cirbp在低氧條件下，通過結(jié)合于HIF-1α蛋白mRNA的3’ UTR區(qū)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。

4、此外，HIF也通過調(diào)控相關(guān)miRNA的水平進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，但這一調(diào)控作用是否參與了細(xì)胞的低氧應(yīng)答過程尚不明確。因此，探討低氧引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的原因及闡明低氧條件下神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)答調(diào)控對于高海拔環(huán)境暴露致機(jī)體尤其是腦損傷機(jī)制的闡明與防護(hù)預(yù)案的制定具有重要意義。
　　研究目的：
　　本研究通過建立低氧暴露的動物模型和細(xì)胞模型，觀察低氧對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，闡明Cirbp蛋白在細(xì)胞凋亡中的作用及分子機(jī)制，初步探討miRNA及

5、HIF1-α在低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用，研究結(jié)果對于防治低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷相關(guān)疾病具有重要意義。
　　研究方法：
　　1.低氧暴露體內(nèi)模型建立：利用低溫低氧復(fù)合實(shí)驗(yàn)艙，建立SD大鼠低氧暴露模型。
　　2.低氧暴露體外模型建立：利用DWS低氧工作站，建立SH-SY5Y細(xì)胞1%低氧暴露模型。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況。
　　4.TUNEL法檢測動物腦片及細(xì)胞爬片凋亡細(xì)胞比率

6、。
　　5.使用Western-blot的方法檢測蛋白表達(dá)水平。
　　6.質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建Cirbp高表達(dá)質(zhì)粒。
　　7.qRT-PCR方法檢測動物組織及細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.低氧暴露對SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響：TUNEL結(jié)果顯示，低氧暴露后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡較對照組明顯增多；Western-blot結(jié)果顯示，低氧暴露后Cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高，B

7、ax/Bcl-2比值也明顯升高。
　　2.低氧暴露對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，1%低氧暴露后，與對照組相比凋亡細(xì)胞明顯增多，且處于凋亡晚期的細(xì)胞數(shù)明顯高于凋亡早期的細(xì)胞數(shù)；TUNEL結(jié)果顯示，低氧暴露后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，與流式結(jié)果一致；Western-blot結(jié)果顯示，低氧暴露后Cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高，Bax/Bcl-2比值也呈上升趨勢。
　　3.低氧暴露對Cirbp蛋白

8、和對HIF1-α蛋白表達(dá)的影響：Western-blot結(jié)果顯示，低氧暴露可以使海馬組織及SH-SY5Y細(xì)胞中Cirbp蛋白表達(dá)水平明顯降低；而HIF1-α表達(dá)水平明顯上升。
　　4.高表達(dá)Cirbp對低氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響：高表達(dá)Cirbp細(xì)胞使用1%低氧處理后，與正常細(xì)胞相比，高表達(dá)Cirbp可部分回轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡比率，且低氧誘導(dǎo)的Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2比值的上升趨勢也均有一定程度的下降。<

9、br>　　5.Cirbp對HIF1-α蛋白表達(dá)的調(diào)控作用：Western-blot結(jié)果顯示，低氧暴露后可以使轉(zhuǎn)染空載體的SH-SY5Y細(xì)胞中HIF1-α表達(dá)水平明顯上升；而轉(zhuǎn)染高表達(dá)Cirbp載體組細(xì)胞低氧暴露后，HIF1-α表達(dá)水平明顯下降。
　　6.低氧暴露動物組織及細(xì)胞中相關(guān)miRNA表達(dá)的影響：qRT-PCR結(jié)果顯示，低氧暴露后，miR-1、miR-23a、miR-27a及miR-322在SD大鼠海馬組織及SH-SY5Y細(xì)

10、胞中表達(dá)升高。
　　7.miR-1在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用：加入miR-1inhibitor或mimics后，低氧暴露的細(xì)胞凋亡無明顯差異；凋亡相關(guān)蛋白也無明顯改變；Cirbp與HIF1-α表達(dá)無明顯變化，說明miR-1與低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能無關(guān)。
　　8.miR-23a在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用：加入miR-23a inhibitor后，低氧暴露的細(xì)胞凋亡明顯高于inhibitor對照組；凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況同流式結(jié)果

11、一致；與inhibitor對照組相比，低氧誘導(dǎo)Cirbp下調(diào)與HIF1-α上調(diào)趨勢均加劇。轉(zhuǎn)染miR-23a mimics后，與mimics對照組相比，低氧暴露后細(xì)胞凋亡水平、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、HIF1-α及Cirbp表達(dá)變化均有一定程度的緩解，說明miR-23a在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中通過Cirbp/HIF1-α發(fā)揮重要作用。
　　研究結(jié)論：
　　1.通過建立低氧暴露的體內(nèi)外模型，證實(shí)了低氧可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
　　

12、2.低氧暴露后Cirbp蛋白表達(dá)下調(diào)，HIF1-α蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　3.高表達(dá)Cirbp蛋白后，低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和HIF1-α水平均有一定程度的緩解，揭示了低氧是通過Cirbp調(diào)控HIF1-α蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　4.低氧暴露后miR-1、miR-23a、miR-27a及miR-322在SD大鼠海馬組織及SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)升高。
　　5.轉(zhuǎn)染miR-1和miR-23a inhibitor或mim