MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導神經細胞凋亡的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　在整體動物水平，研究MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注（MCAO/R）誘導神經細胞凋亡的影響及其機制。
　　方法：
　　1、慢病毒介導的MRTF-A（LV-MRTF-A）在大鼠腦皮層中表達的分布及時間相關性的研究：①30只 SPF級 SD大鼠隨機分為5組，以注射陰性慢病毒（NEG-LV）為對照組，其余4組分別腦室注射LV-MRTF-A1μl、2μl、4μl、5μl，于第5d取全腦做石蠟切片，用激光共聚焦顯微鏡觀

2、察 MRTF-A表達；②取腦室注射4μl LV-MRTF-A5d的腦組織，激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠腦皮層不同部位MRTF-A表達；③36只SPF級SD大鼠隨機分為6組，腦室注射LV-MRTF-A后，分別于1d、3d、5d、7d、9d取全腦組織做石蠟切片，激光共聚焦顯微鏡觀察各組腦皮層中MRTF-A表達。
　　2、MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導的神經細胞凋亡的影響：84只SPF級SD大鼠隨機分成3組：對照組、模型組、實驗組。對照

3、組與模型組分別腦室注射4μl NEG-LV；實驗組腦室注射4μl LV-MRTF-A。腦室注射4天后，實驗組與模型組分別構建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h、MCAO2h/R72h），用Longa’s法進行神經功能評分；用TTC染色評價腦梗塞體積；用TUNEL法檢測細胞凋亡率。
　　3、MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導神經細胞凋亡作用機制：54只SPF級SD大鼠隨機分成3組：對照組、模型組、實驗組。

4、對照組與模型組分別腦室注射4μl NEG-LV；實驗組腦室注射4μl LV-MRTF-A。腦室注射4天后，實驗組與模型組分別構建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h），用Real-time PCR檢測腦皮層中MRTF-A、caspase3及Mcl-1 mRNA表達；用Western blot檢測腦皮層中MRTF-A、CC3及 Mcl-1蛋白表達；用免疫熒光法檢測腦皮層細胞色素 C、Apaf-1、CC3、Mcl-1表達。
　　結果

5、：
　　1、LV-MRTF-A在大鼠腦皮層感染劑量研究發(fā)現：大鼠腦室注射不同劑量LV-MRTF-A5d后，1μl和2μl組MRTF-A表達較低，與2μl組對比，4μl和5μl組 MRTF-A表達明顯增加，且兩組表達無差異；LV-MRTF-A在大鼠腦皮層中分布研究發(fā)現：大鼠腦室注射4μl LV-MRTF-A5d后，MRTF-A在腦皮層中廣泛表達，以注射點及其四周表達最高，注射點遠端表達量逐漸下降；LV-MRTF-A在大鼠腦皮層中感染

6、時間研究發(fā)現：大鼠腦室注射4μl LV-MRTF-A后，1d、3d有少量MRTF-A表達，5d、7d MRTF-A表達相比3d呈明顯上升趨勢，9d表達量相比7d降低。
　　2、MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導的神經細胞凋亡的影響研究發(fā)現：模型組神經功能評分及腦梗死體積與對照組相比有顯著性差異（P＜0.01），實驗組神經功能評分及腦梗死體積與模型組的同一再灌注時間點組比較，均顯著減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）；

7、TUNEL法檢測神經細胞凋亡率表明，與對照組比較，模型組凋亡率明顯增加（P＜0.05或 P＜0.01），且隨著再灌注時間延長，凋亡率呈逐漸下降趨勢。實驗組與模型組的同一再灌注時間點對比，細胞凋亡率均顯著下降，且具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3、MRTF-A抗大鼠腦缺血再灌注誘導凋亡的機制研究發(fā)現：大鼠腦室注射4μl LV-MRTF-A后，大鼠腦皮層中MRTF-A mRNA及蛋白表達顯著上升。Real-time

8、 PCR結果顯示，與對照組比較，模型組caspase-3 mRNA表達明顯增加，Mcl-1 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）。與模型組對比，實驗組caspase-3 mRNA表達明顯下降，Mcl-1mRNA表達明顯增加（P＜0.01）。Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組CC3蛋白表達明顯增加，Mcl-1蛋白表達明顯下降（P＜0.01）。與模型組對比，實驗組 CC3蛋白表達明顯下降，Mcl-1蛋白表達明顯增加（P＜

9、0.01）；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現：MCAO2h/R24h誘導cyt C與Apaf-1高表達，且兩者表達交集區(qū)域范圍廣，CC3表達明顯增加，Mcl-1表達明顯下降。腦室注射MRTF-A后，cyt C與Apaf-1表達及交集區(qū)域均明顯減少；CC3表達明顯下降, Mcl-1表達明顯增加。
　　結論：
　　1、LV-MRTF-A最佳注射劑量為4μl，LV-MRTF-A最強表達時段為注射后第5d-7d，且以注射點為 LV-MRTF