HUMMR在低氧誘導(dǎo)神經(jīng)元線粒體損傷中的作用研究.pdf

1、在我國青藏高原由于平均海拔過高，導(dǎo)致空氣中平均氧含量只有13％左右，遠低于正常大氣壓中21%的氧含量。研究表明，長期暴露于高原環(huán)境中會影響人類神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及其功能，從而影響大腦的學習記憶功能。
　　大腦海馬體內(nèi)神經(jīng)元主要負責學習和記憶，而功能正常的神經(jīng)元及神經(jīng)元可塑性是大腦學習記憶的關(guān)鍵。高原低氧暴露會引起神經(jīng)元的損傷，導(dǎo)致學習記憶功能障礙。神經(jīng)元中線粒體對神經(jīng)元的發(fā)育、生長及功能實現(xiàn)起著重要作用，同時也是低氧暴露神經(jīng)元損傷的敏

2、感細胞器，低氧暴露會誘導(dǎo)線粒體損傷。HUMMR蛋白是一種定位于線粒體外膜的低氧應(yīng)激蛋白，對神經(jīng)元軸突內(nèi)線粒體運輸起到調(diào)節(jié)作用，而HUMMR是否參與低氧導(dǎo)致的線粒體損傷過程尚未見報導(dǎo)。線粒體融合分裂平衡的破壞是線粒體損傷的前期表現(xiàn)，其相關(guān)蛋白是參與線粒體損傷的重要蛋白。MEF2（Myocyte enhancer factor,肌細胞增強因子）蛋白家族隸屬轉(zhuǎn)錄因子MADS轉(zhuǎn)錄因子家族，其中MEF2D可能通過調(diào)節(jié)其他核基因或線粒體基因轉(zhuǎn)錄參與

3、線粒體功能的調(diào)節(jié)，進而影響神經(jīng)元生存及其正常功能維持，但是MEF2D、HUMMR和線粒體融合、分裂相關(guān)蛋白在低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中的作用及分子機制有待于進一步研究。
　　目的：
　　本研究通過建立低氧誘導(dǎo)線粒體損傷的體外模型，觀察低氧對神經(jīng)元線粒體損傷的影響及特點，闡明HUMMR蛋白在線粒體損傷中作用及分子機制，揭示MEF2D對HUMMR蛋白及線粒體損傷的調(diào)控作用，研究結(jié)果對于預(yù)防和治療低氧誘導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)疾病具有重要意

4、義。
　　方法：
　　1.低氧暴露細胞模型的建立：利用DWS低氧工作站，建立SH-SY5Y細胞及原代培養(yǎng)神經(jīng)元1%低氧暴露模型。
　　2.質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建HUMMR-GFP高表達質(zhì)粒、HUMMR-shRNA干涉慢病毒質(zhì)粒。
　　3.慢病毒載體的構(gòu)建：采用ps-PAX2、pMD2.G、HUMMR-shRNA-PLKO重組慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝成完整病毒。
　　4.免疫熒光染色方法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡

5、檢測線粒體形態(tài)：用Mito-Tracker Red線粒體熒光探針及pDsRed2-Mito質(zhì)粒染色線粒體，用激光共聚焦觀察線粒體分布及形態(tài)變化。
　　5.線粒體膜電位檢測：通過JC1（線粒體膜電位檢測法）染色，熒光顯微鏡觀察細胞膜電位變化。
　　6.用電子顯微鏡方法觀察細胞內(nèi)線粒體的超微結(jié)構(gòu)。
　　7.利用western-blot的方法檢測蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.低氧暴露對線粒體形態(tài)和功能的影響

6、：免疫組織化學結(jié)果顯示，1%低氧暴露24h和48h后，與對照組相比，SH-SY5Y細胞及原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞的線粒體均出現(xiàn)不同程度的片斷化；線粒體膜電位水平明顯下降。
　　2.低氧暴露對線粒體相關(guān)蛋白表達的影響：western-blot結(jié)果顯示：低氧暴露后可以使HUMMR蛋白、MEF2D蛋白和線粒體融合蛋白MFN2表達水平明顯降低。
　　3.高表達HUMMR對低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化的影響：高表達HUMMR的細胞用1%低氧處理，

7、與正常表達HUMMR的細胞相比，高表達HUMMR可以部分改善低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化，低氧誘導(dǎo)的MFN2蛋白表達下降也有一定程度的回升。
　　4.低表達HUMMR對低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化的影響：低表達HUMMR的細胞用1%低氧處理，與正常表達HUMMR的細胞相比，低表達HUMMR加劇了低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化和MFN2蛋白表達下降。
　　5.MEF2D對低氧誘導(dǎo)的HUMMR蛋白表達及線粒體片斷化的調(diào)控作用：（1）與對照組相比，低

8、氧暴露后MEF2D水平呈下降趨勢。（2）高表達MEF2D后，可部分恢復(fù)低氧誘導(dǎo)的線粒體片斷化，同時低氧誘導(dǎo)的 HUMMR蛋白水平下降也有一定程度的回升。
　　結(jié)論：
　　本研究通過建立低氧誘導(dǎo)線粒體損傷的體外模型，證實低氧可以引起神經(jīng)元線粒體片斷化和膜電位水平下降，發(fā)現(xiàn)HUMMR蛋白在其中發(fā)揮著重要作用，闡明了低氧是通過核轉(zhuǎn)錄因子MEF2D調(diào)節(jié)HUMMR進而影響線粒體融合蛋白MFN2的表達水平，最終導(dǎo)致了線粒體片斷化的發(fā)生，