AVM誘導王鴿腦神經(jīng)細胞凋亡的線粒體通路研究.pdf

1、本課題以體外培養(yǎng)王鴿腦神經(jīng)細胞為研究對象，進行2.5μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L三種不同劑量AVM的染毒處理，通過對王鴿腦神經(jīng)細胞的存活率、細胞的形態(tài)學變化、生化特征變化、LDH漏出率、NO產(chǎn)生量；線粒體活性、線粒體膜電位、線粒體氧化應激、細胞內(nèi)游離鈣離子濃度及細胞內(nèi)CaMmRNA表達、細胞內(nèi)Caspase酶活性以及Caspase-3mRNA表達等凋亡影響因素的觀察，探討了AVM對神經(jīng)細胞毒性作用的劑量效應關系，以闡述AV

2、M對神經(jīng)細胞影響的線粒體機制。研究結果表明： 1.應用AO-EB雙熒光染色、HE染色、透射電鏡以及Tunel法，觀察培養(yǎng)液中添加三種不同劑量AVM對神經(jīng)細胞毒性作用，從形態(tài)學角度證實AVM能夠引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡，且神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)與培養(yǎng)液中添加AVM的劑量呈正相關。 2.應用瓊脂糖凝膠電泳、酶標儀、流式細胞術等方法，觀察培養(yǎng)液中添加三種不同劑量AVM對神經(jīng)細胞的DNA損傷以及磷脂酰絲氨酸(PS)的影響情況，從生化特征角度證

3、實了AVM能夠引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡，神經(jīng)細胞的膜對稱性消失，且影響程度與培養(yǎng)液中添加AVM劑量有關。 3.通過檢測神經(jīng)細胞的LDH漏出率和NO產(chǎn)生量，證實AVM能引起神經(jīng)細胞的膜通透性增加，NO產(chǎn)生量減少。 4.采用四唑鹽比色法(MTT法)觀察AVM對神經(jīng)細胞的線粒體活性的影響，結果表明培養(yǎng)液中添加三種不同劑量AVM均能使神經(jīng)細胞線粒體活性降低，且神經(jīng)細胞線粒體活性變化與培養(yǎng)液中添加AVM的劑量呈正相關，證實AVM能損傷神經(jīng)

4、細胞的線粒體。 5.應用流式細胞術觀察線粒體膜電位和細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生情況，結果顯示培養(yǎng)液中添加三種不同劑量AVM均能引起神經(jīng)細胞氧化應激，線粒體膜電位下降，證實AVM通過氧化應激損傷線粒體介導細胞凋亡。 6.應用半定量RT-PCR法和比色法檢測Caspase-3mRNA表達水平和Caspase-3、8、9活性，結果顯示AVM能夠引起細胞內(nèi)Caspase-3mRNA表達水平上升，Caspase-3活性增加，Ca

5、spase-9活性也增加，Caspase-8在AVM濃度為2.5μg·L-1時活性增強，其它劑量組變化不明顯，證實AVM可通過線粒體途徑激活Caspase酶系統(tǒng)導致神經(jīng)細胞凋亡。 7.應用半定量RT-PCR法和熒光探針法檢測細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平和游離鈣離子濃度，結果表明AVM能夠引起鴿神經(jīng)細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平下降，游離鈣離子濃度升高，干擾細胞鈣離子的轉(zhuǎn)運，導致細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，證實AVM能通過影響細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)損傷線