α-突觸核蛋白在阿維菌素致王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用研究.pdf

1、阿維菌素(Avermectin，AVM)廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)以及畜牧業(yè)，具有較高的安全性，驅(qū)蟲(chóng)效果也很好，隨著其使用量的增加，阿維菌素在環(huán)境中的殘留量也隨之增加。我們實(shí)驗(yàn)室在之前的工作中發(fā)現(xiàn)，阿維菌素暴露能夠引起王鴿神經(jīng)中毒的癥狀，隨后研究發(fā)現(xiàn)阿維菌素可以導(dǎo)致王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞自噬樣形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)王鴿急性阿維菌素暴露，發(fā)現(xiàn)阿維菌素可以誘導(dǎo)α-突觸核蛋白在王鴿腦組織中的表達(dá)水平顯著升高。由于α-突觸核蛋白與神經(jīng)細(xì)胞的自噬作用

2、具有相關(guān)性。為了探究阿維菌素誘導(dǎo)的王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞自噬中α-突觸核蛋白基因的作用，本研究制備王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞阿維菌素染毒模型并對(duì)α-突觸核蛋白基因進(jìn)行敲低，對(duì)其敲低前后王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)使用透射電鏡技術(shù)進(jìn)行觀察，檢測(cè)了自噬相關(guān)基因的核酸和蛋白的表達(dá)水平，對(duì)于在阿維菌素誘導(dǎo)的王鴿神經(jīng)細(xì)胞自噬模型中α-突觸核蛋白的作用進(jìn)行了討論。結(jié)果如下：
　　(1)制備抗王鴿動(dòng)力蛋白多克隆抗體。對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行5次背部多點(diǎn)注射免疫后，對(duì)抗體的

3、效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果為1∶25600。此抗體可以對(duì)王鴿腦細(xì)胞中動(dòng)力蛋白的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　(2)將鴿胚于孵化箱中孵化7-8天后按照常規(guī)方法應(yīng)用Neurobasal商品化培養(yǎng)基對(duì)王鴿腦神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)方式進(jìn)行優(yōu)化。使用神經(jīng)細(xì)胞烯醇化酶免疫染色對(duì)王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。
　　(3)使用Stealth RNA(S-RNA)對(duì)王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較高。
　　(4)通過(guò)熒光定量PCR和Western

4、Bolt技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞在阿維菌素染毒后，TOR在核酸水平的表達(dá)受到明顯的抑制，LC3、Beclin1、Dynein的蛋白及核酸水平均增加，增加了ATG5、ATG4B核酸水平的表達(dá)，比較于敲低前，敲低α-突觸核蛋白基因后LC3、Beclin1、Dynein、ATG5、ATG4B的核酸水平顯著降低。這些結(jié)果提示阿維菌素染毒誘導(dǎo)了王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞的自噬作用;敲低α-突觸核蛋白基因后阿維菌素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用降低。

5、提示α-突觸核蛋白參與阿維菌素引起的王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞自噬改變。
　　(5)通過(guò)透射電鏡檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞阿維菌素染毒后自噬體數(shù)量增加，自噬水平升高，敲低α-突觸核蛋白基因后，自噬體數(shù)量較染毒組數(shù)量明顯減少。同樣提示α-突觸核蛋白參與阿維菌素引起的王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞自噬的改變。
　　綜上，阿維菌素可以誘導(dǎo)王鴿胚腦神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及自噬相關(guān)基因核酸和蛋白表達(dá)水平的改變，提高了自噬水平。α-突觸核蛋白基因敲低后能夠緩解