γ突觸核蛋白激活AKT在非小細胞肺癌發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、近年來肺癌的發(fā)病率在全球呈迅速上升趨勢，是癌癥死亡的重要原因，全世界每年新確診的肺癌患者達到180萬，其中每年超過100萬人因肺癌死亡，其死亡率40年間上升近10倍。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的最常見類型、占肺癌的80％左右。目前非小細胞肺癌的治療手段主要包括:早期的手術治療，晚期的放化療、分子靶向治療、生物免疫治療及局部介入治療等等，肺癌患者早期多無臨床癥狀，60％多的患者就

2、診時因處于晚期或心肺功能差而不能行手術治療，對于不能手術治療的患者采用放化療、局部介入治療及姑息治療等，其5年生存率低。隨著醫(yī)學技術的不斷進步，人們針對EGFR等基因突變研發(fā)了靶向藥物，顯著改善了非小細胞肺癌的治療現狀，有突變基因的患者應用這些靶向藥物治療效果好，但無基因突變患者應用這些藥物治療效果差，而且靶向治療并非一直有效、這些患者最終都會出現耐藥。因此進一步深入研究非小細胞肺癌發(fā)病的分子機制、侵襲轉移途徑、關鍵信號轉導通路，探尋更

3、為有效的肺癌早期診斷、早期治療手段具有重要意義;如能發(fā)現新的腫瘤標志物，早期發(fā)現肺癌，并針對發(fā)病機制進行干預阻止其進一步侵襲發(fā)展，將會有更多患者收益。
　　目前的研究發(fā)現肺癌的發(fā)病與下列因素有關:1.吸煙:吸煙是肺癌的重要危險因素，煙草中含有各種致癌物質，其中苯并芘為主要的致癌物。2.職業(yè)因素:職業(yè)接觸中的石棉，含坤無機化合物，鉻及其化合物，不完全燃燒的煤、油等產生的多環(huán)芳烴等是已經確認的職業(yè)致肺癌因素。3.空氣污染:包括室內小環(huán)

4、境及室外大環(huán)境污染。4.電離輻射:高劑量電離輻射可引起肺癌。5.飲食與營養(yǎng):飲食中的維生素A、胡蘿卜素等可抑制化學致癌物所誘發(fā)的肺癌。6.其他:如肺結核患者發(fā)生肺癌的危險性是正常人群的8-10倍，此外病毒感染、真菌產生的毒素、機體免疫功能失衡等因素對肺癌的發(fā)生也起到促進作用。7.遺傳和基因改變:目前認為肺癌可能是外界環(huán)境因素和機體遺傳因素相互作用的結果。外界致癌物質可誘發(fā)人體內某些癌基因及抑癌基因表達的失衡，抑制癌細胞的凋亡，導致細胞癌

5、變并生長失控，該過程涉及多個基因、通路、細胞因子的參與，其中PI3K/AKT信號通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，該通路的過度活化可促進癌細胞的增殖、侵襲并抑制癌細胞的凋亡。
　　AKT又稱蛋白激酶B/PKB，是參與PI3K/AKT通道的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是病毒癌基因(v-akt)的細胞同源物，參與調控細胞增殖、存活、分化、粘附、運動等，AKT可被EGFR等幾個跨膜受體激活，與配體結合激活后，EGFR募集磷脂酰肌醇-3-激

6、酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)至細胞膜，PI3K將細胞膜上的磷脂肌醇二磷酸磷酸化，產生磷脂酰肌醇三磷酸，后者作為第二信使與AKT結合，促進AKT磷酸化，并與多種效應蛋白相互作用將信號從細胞膜導入細胞內，AKT持續(xù)活化是發(fā)揮其促細胞增殖、抑制細胞凋亡的重要機制。活化的PI3K/AKT信號通路可通過多條途徑參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展:包括激活mTOR、P21cipl、GSK-3、CREB及TSC2等參與

7、癌細胞的增殖;通過Bcl-2家族、細胞凋亡抑制蛋白、Forkhead轉錄因子、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族等抑制腫瘤細胞的凋亡;通過激活mTOR/p70S6K參與癌細胞的運動、侵襲、轉移等。p-AKT是AKT的活化形式，研究發(fā)現p-AKT在正常肺組織中基本不表達，而在非小細胞肺癌組織中的表達明顯升高，提示AKT的活化在細胞的癌變過程中發(fā)揮重要作用，AKT在非小細胞肺癌中異常激活的分子機制仍需進一步探討。
　　由人γ-synuc

8、lein(SNCG)基因編碼的γ突觸核蛋白（又稱為乳腺癌特異性蛋白），是乳腺癌致癌基因及分子標志物，與突觸核蛋白家族中的α突觸核蛋白(SNCA)、β突觸核蛋白(SNCB)分別有55.9％和54.3％的同源性，但其染色體定位及功能不同。目前研究發(fā)現γ突觸核蛋白不僅在乳腺癌組織中高表達，在包括肺癌在內的多種人類癌變組織中也發(fā)現了γ突觸核蛋白的異常高表達，且隨腫瘤進展其表達水平逐漸升高。研究發(fā)現γ突觸核蛋白啟動子區(qū)的CpG島異常甲基化是造成γ

9、突觸核蛋白在腫瘤中異常高表達的主要原因，并可通過抑制有絲分裂檢查點重要激酶BubR1的功能、導致不正常的細胞分裂促進腫瘤細胞的增殖。γ突觸核蛋白的過表達能夠促進肺癌的發(fā)生、增殖、侵襲及耐藥，對非小細胞肺癌組織和正常肺組織中γ突觸核蛋白表達的研究顯示，非小細胞肺癌組織表達陽性率(46.7％)明顯高于正常肺組織(0)且差異有統(tǒng)計學意義。但是γ突觸核蛋白在肺癌細胞增殖和存活中的作用機制尚不明確。
　　一些蛋白與AKT結合并調節(jié)其激酶活性

10、發(fā)揮作用，如在神經元中β突觸核蛋白與AKT結合并促進AKT活化，進而保護神經元細胞免受魚藤酮的毒性損傷。γ突觸核蛋白與β突觸核蛋白同屬突觸核蛋白家族且有高度同源性，晚期乳腺癌可同時表達β突觸核蛋白、γ突觸核蛋白。本研究中，探討了γ突觸核蛋白和AKT的相互作用及其在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。首先觀察了非小細胞肺癌組織和正常對照組織中γ突觸核蛋白、AKT和p-AKT表達的差異，發(fā)現非小細胞肺癌組織中γ突觸核蛋白及p-AKT表達明顯

11、增加，免疫共沉淀等發(fā)現γ突觸核蛋白與AKT的激酶結構域結合，進一步實驗發(fā)現γ突觸核蛋白過表達可增加AKT磷酸化及活化、促進EGF誘導的癌細胞增殖，抑制星形孢菌素(STR)誘導的細胞凋亡、促進癌細胞存活，并證實了γ突觸核蛋白促進肺癌細胞增殖和存活的作用通過激活AKT來實現。
　　總之，發(fā)現γ突觸核蛋白與AKT相互作用，導致AKT持續(xù)活化，促進非小細胞肺癌增殖和存活，我們的研究闡明了γ突觸核蛋白及AKT在肺癌發(fā)病機制中的新作用，為非小

12、細胞肺癌的早期診斷和治療提供新的靶點和理論依據。
　　第一部分 γ突觸核蛋白與AKT在非小細胞肺癌組織中的表達及兩者的關系
　　目的：
　　觀察NSCLC組織與自身癌旁對照組織中γ突觸核蛋白、p-AKT、AKT表達的差異，明確γ突觸核蛋白與AKT活化之間的關系。
　　方法：
　　1.Western blot檢測NSCLC組織及對照組織中AKT、p-AKT及γ-突觸核蛋白表達的差異。
　　2.免疫共沉淀

13、檢測人NSCLC組織中γ突觸核蛋白與AKT的關系。
　　3.GST pull-down實驗明確γ突觸核蛋白與AKT結合的結構域。
　　4.SNCG質粒轉染H157細胞使γ突觸核蛋白過表達，AKT活性檢測試劑盒及Western blot檢測AKT磷酸化及活性的變化。
　　5.SNCG siRNA敲低H157細胞中γ突觸核蛋白的表達，AKT活性檢測試劑盒及Western blot檢測AKT磷酸化及活性的變化。
　　結

14、果：
　　1.NSCLC組織中p-AKT、γ突觸核蛋白的表達較對照組明顯升高，但兩組之間總AKT的表達無明顯差異，提示NSCLC組織中γ突觸核蛋白高表達，AKT通路活化。
　　2.NSCLC組織中γ突觸核蛋白與AKT相互結合。
　　3.γ突觸核蛋白與AKT全長及a.a.1-408片段結合，與a.a.1-108片段無結合，提示γ突觸核蛋白結合AKT的激酶結構域。
　　4.γ突觸核蛋白的過表達促進了AKT的活化。

15、r>　　5.敲低γ突觸核蛋白的表達后EGF誘導的AKT磷酸化及活化下降。
　　結論：
　　1.γ突觸核蛋白與AKT激酶結構域相結合。
　　2.γ突觸核蛋白促進AKT的磷酸化及活化。
　　第二部分 γ突觸核蛋白通過激活AKT促進非小細胞肺癌細胞增殖和存活的作用研究
　　目的：
　　進一步探討γ突觸核蛋白通過激活AKT在促進非小細胞肺癌增殖和存活中的作用及機制。
　　方法：
　　1.使用SNC

16、G siRNA敲低H157細胞中γ突觸核蛋白的表達，應用MTT法及Western blot檢測增殖細胞核抗原PCNA表達的變化，觀測EGF介導的癌細胞增殖的變化。
　　2.通過SNCG質粒使H157細胞中γ突觸核蛋白過表達，應用MTT法及Western blot檢測active caspase-3表達變化，觀測STR介導的癌細胞凋亡的變化。
　　3.使用AKT siRNA敲低H157細胞中AKT表達，MTT法檢測γ-突觸核蛋

17、白促癌細胞增殖的變化。
　　4.使用AKT siRNA敲低H157細胞中AKT表達，MTT法檢測γ-突觸核蛋白對STR介導的細胞毒性的保護作用的變化。
　　結果：
　　1.敲低γ突觸核蛋白的表達后，EGF介導的癌細胞增殖作用顯著降低。
　　2.γ突觸核蛋白過表達，減弱了STR介導的癌細胞凋亡作用。
　　3.敲低AKT的表達，γ突觸核蛋白的促癌細胞增殖作用減弱。
　　4.敲低AKT的表達，減弱了γ突觸核