銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞清除α-突觸核蛋白作用的影響及機(jī)制.pdf

1、帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是全球第二大老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為腦內(nèi)黑質(zhì)致密部多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，紋狀體DA含量顯著降低，同時(shí)伴有神經(jīng)元內(nèi)路易小體(Lewybody，LB)沉積及路易神經(jīng)突(Lewy neuritis)形成。α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是一種主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜的可溶性蛋白，生理功能包括參與調(diào)節(jié)DA生物合成與釋

2、放、調(diào)節(jié)突觸可塑性、參與脂質(zhì)代謝及發(fā)揮分子伴侶功能等。α-syn也是LB的主要結(jié)構(gòu)成分，它的異常積聚與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在PD進(jìn)程中，α-syn單體異常積聚形成聚集體，沉積于神經(jīng)元中發(fā)揮毒性作用，其中，A53T突變型α-syn更容易發(fā)生聚集。神經(jīng)元可釋放α-syn至胞外，被鄰近的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞攝取，引起α-syn在腦內(nèi)的傳播，并誘發(fā)炎癥、神經(jīng)元退行性變等一系列病理反應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centr

3、al nervoussystem，CNS)發(fā)育、神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)、支持以及腦內(nèi)微環(huán)境的維持發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬與清除功能逐漸受到重視。在帕金森病中，從神經(jīng)元釋放的α-syn進(jìn)入突觸間隙，可被星形膠質(zhì)細(xì)胞吞噬并清除。因此，深入研究星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)α-syn的清除作用及其機(jī)制，調(diào)節(jié)其清除α-syn的能力，減少異常激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞病理反應(yīng)，有助于闡明PD的病理過(guò)程并探索基于星形膠質(zhì)細(xì)胞的PD治療新策略。銀杏內(nèi)酯B(Ginkgol

4、ide B，GB)和白果內(nèi)酯(Bilobalide，BB)是從銀杏葉中提取的萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、DNA損傷修復(fù)等功能，主要用于缺血性腦卒中等腦血管疾病的治療。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)GB和BB對(duì)阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用。深入研究闡明GB和BB對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞清除α-syn功能的調(diào)節(jié)作用，將有利于進(jìn)一步深化對(duì)GB和BB神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的藥理作用新機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：α-syn單體

5、和聚集體制備及其神經(jīng)毒性鑒定。
　　目的：制備WT和A53Tα-syn單體和聚集體，并鑒定其神經(jīng)毒性。
　　方法：構(gòu)建WTα-syn和A53Tα-syn蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28b(+)-WT及pET-28b(+)-A53T并鑒定。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)煮沸、酸沉淀、硫酸銨沉淀方法

6、進(jìn)行蛋白純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度，western blotting及MALDI蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白鑒定。α-syn單體(1 mg/ml)溶于PBS，37℃，250 rpm振搖14天，短暫超聲，制備WT/A53Tα-syn聚集體，通過(guò)western blotting、硫磺素T(Thioflavin T，ThT)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及電鏡鑒定α-syn聚集體結(jié)構(gòu)。SH-SY5Y細(xì)胞給予不同濃度的α-syn單體和聚集體刺激，MTT實(shí)驗(yàn)和

7、LDH檢測(cè)觀察細(xì)胞損傷，流式細(xì)胞術(shù)及western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡。SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)孵育GB和BB2h后給予MPP+(200μM)和WTα-syn聚集體(1μM)刺激24h，MTT實(shí)驗(yàn)和LDH檢測(cè)觀察SH-SY5Y細(xì)胞活力，明場(chǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)，western blotting檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白水平。
　　結(jié)果：⑴BLAST序列比對(duì)顯示，構(gòu)建的pET-28b(+)-WT蛋白表達(dá)質(zhì)粒插入片段的堿基排列順序與

8、人源性SNCA一致，pET-28b(+)-A53T插入片段相對(duì)于SNCA的第157個(gè)堿基由G突變?yōu)锳；⑵目的蛋白純度均大于90％，westernblotting及MALDI蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析鑒定純化獲得的蛋白是α-syn蛋白；⑶westernblotting結(jié)果顯示W(wǎng)T和A53Tα-syn蛋白聚集體在55～70 kD位置出現(xiàn)明顯的目標(biāo)條帶;WT和A53Tα-syn聚集體ThT結(jié)合力相對(duì)于單體顯著增加，A53Tα-syn較WTα-syn增加更

9、明顯;電鏡下α-syn呈現(xiàn)聚集結(jié)構(gòu)；⑷WT和A53Tα-syn聚集體呈濃度依賴性引起SH-SY5Y細(xì)胞活力下降和LDH釋放增加;α-syn聚集體顯著增加SH-SY5Y的AnnexinⅤ/PI標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，降低SH-SY5Y細(xì)胞Bcl2/Bax蛋白比例;5）GB和BB抑制MPP+及α-syn聚集體誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力下降和LDH釋放增加，抑制α-syn聚集體引起的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)改變和Bcl2/Bax比值下降。
　　

10、結(jié)論：①WTα-syn和A53Tα-syn單體和聚集體制備成功。②WTα-syn和A53Tα-syn聚集體具有神經(jīng)毒性作用。③GB和BB抑制α-syn誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分：銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞清除α-syn作用的影響。
　　目的：研究GB和BB對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞清除α-syn作用的影響及機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)小鼠原代中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光觀察GFAP陽(yáng)性率。給予星形膠質(zhì)細(xì)胞α-

11、syn單體和聚集體刺激不同時(shí)間，western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞α-syn水平。FITC標(biāo)記WTα-syn聚集體，給予星形膠質(zhì)細(xì)胞刺激，觀察FITC與GFAP共標(biāo)。星形膠質(zhì)細(xì)胞給予WTα-syn單體和聚集體，孵育1h撤掉培養(yǎng)基，用DMEM洗兩遍后繼續(xù)正常培養(yǎng)不同時(shí)間，western blotting和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)胞內(nèi)α-syn含量。星形膠質(zhì)細(xì)胞給予α-syn單體或聚集體刺激1h，撤掉培養(yǎng)基，DMEM洗兩遍后加入含蛋白酶體

12、抑制劑MG132或自噬抑制劑3MA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h（單體）或24h（聚集體），western blotting和免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞α-syn含量。星形膠質(zhì)細(xì)胞孵育溶酶體標(biāo)記物L(fēng)ysoTracker和FITC-WTα-syn聚集體1h，觀察LysoTracker與α-syn共定位。星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)孵育GB和BB2h，給予α-syn聚集體刺激24h，檢測(cè)胞內(nèi)或上清α-syn水平。星形膠質(zhì)細(xì)胞給予α-syn聚集體刺激1h，撤掉培養(yǎng)基，給予GB

13、和BB以及MG132或3MA處理24h，western blotting檢測(cè)α-syn、cathepsin B與LC3Ⅱ/Ⅰ水平。星形膠質(zhì)細(xì)胞給予GB和BB處理不同時(shí)間，western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)指標(biāo)。星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)孵育GB和BB24h，撤掉培養(yǎng)基，給予α-syn聚集體刺激24h，收集細(xì)胞上清，westernblotting檢測(cè)上清中α-syn含量。SH-SY5Y給予星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激24h，MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞

14、活力，并檢測(cè)細(xì)胞LDH釋放。
　　結(jié)果：⑴Western blotting顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下不表達(dá)α-syn，給予α-syn單體和聚集體刺激后胞內(nèi)可檢測(cè)到α-syn，而上清中α-syn含量逐漸降低；⑵星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP與FITC-WTα-syn聚集體共定位；⑶Western blotting和免疫熒光顯示，撤掉外源性α-syn單體和聚集體后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)α-syn含量逐漸降低；⑷蛋白酶體抑制劑MG132和自噬抑制劑3M

15、A抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)α-syn含量的降低；⑸星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的α-syn與溶酶體存在共定位；⑹GB和BB進(jìn)一步降低星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)α-syn含量；⑺給予MG132和3MA后，GB和BB降低α-syn的作用被部分取消;GB和BB降低星形膠質(zhì)細(xì)胞p62表達(dá)，增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例；⑻GB和BB預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基抑制α-syn聚集體刺激的條件培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力下降和LDH釋放。
　　結(jié)論：①星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取