自噬介導的α-突觸核蛋白降解在GM1緩解MPTP所致的帕金森病中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　帕金森?。≒arkinson’s Disease，PD）是多發(fā)于中老年人的第二大神經系統(tǒng)退行性疾病，主要的病理特征為中腦黑質致密部多巴胺能神經細胞的損傷和神經元內路易小體的出現。多巴胺能神經細胞的損傷是臨床診斷和治療帕金森病患者的重要依據，目前藥物治療的靶點也多數圍繞恢復多巴胺神經遞質的水平，如抑制單胺氧化酶B、激動多巴胺受體和抑制膽堿能神經等；但基于改善多巴胺水平的臨床治療藥物并不能徹底治愈帕金森病，另一方

2、面，針對降解或清除路易小體的藥物還處于研究階段。異常聚集的α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）是路易小體的最主要成分，此蛋白在神經元內能夠調節(jié)突觸囊泡的循環(huán)、多巴胺的釋放、酪氨酸羥化酶（TH）的活性等，因此清除異常聚集的α-syn可能是治療帕金森病的潛在靶點。
　　神經節(jié)苷脂（GM1）是臨床用于治療帕金森病的藥物。動物行為學實驗和臨床數據都證明GM1具有緩解帕金森病癥狀的效果，能夠修復受損的神經元；但其具體的分子機

3、制仍需要進一步探索。本實驗旨在探索GM1保護MPTP誘導的帕金森病損傷的作用機制。
　　研究方法：
　?。?）在動物水平上評價GM1抗PD的藥效，同時觀察GM1與自噬的關聯(lián)
　　實驗使用C57BL/6小鼠，分組情況為：空白對照組、GM1高劑量組（GM1-H）、MPTP模型組、MPTP+GM1低劑量組（MPTP+GM1-L）、MPTP+GM1高劑量組（MPTP+GM1-H）、MPTP+3-MA+GM1高劑量組（MPTP+

4、GM1-H+3-MA）和MPTP+司來吉蘭組（MPTP+Sele），每組15只。除空白對照組和GM1高劑量組，其他小鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg/d），連續(xù)注射5天，建立帕金森病的亞急性動物模型。MPTP造模5天后，根據組別連續(xù)兩周給予相應的GM1、3-MA和Sele，空白對照組和MPTP組給予相應的生理鹽水。GM1給藥方式為腹腔注射，低劑量為25 mg/kg/d，高劑量為50 mg/kg/d；3-MA給藥方式為腹腔注射，于GM

5、1給藥前30分鐘先注射，劑量15 mg/kg/d；Sele給藥方式灌胃，劑量為60 mg/kg/d。給藥結束后對小鼠進行行為學實驗的評價，包括爬桿實驗、轉棒實驗和CatWalk步態(tài)分析，分別檢測小鼠的運動能力。
　?。?）在細胞水平上探索GM1抗PD的作用機制
　　用MPTP的活性代謝產物MPP+造成SH-SY5Y細胞的帕金森病損傷模型。然后在MPP+損傷基礎上給予一系列濃度GM1（去掉含有MPP+的培養(yǎng)液，加入含有GM1的

6、培養(yǎng)液），觀察其對細胞損傷的保護作用，最終選擇40μM GM1作用24小時。
　　使用顯微鏡觀察 GM1對 MPP+作用后細胞形態(tài)的影響，采用 Western Blot檢測GM1對PD模型細胞α-syn和酪氨酸羥化酶（TH）水平的影響，同時觀察GM1對自噬相關蛋白LC3I向LC3II轉化作用的影響。采用Western Blot和激光共聚焦顯微鏡觀察GM1對正常SH-SY5Y細胞自噬量的影響。最后采用激光共聚焦顯微鏡觀察α-syn和

7、LC3標記的自噬小體的共定位，以探索GM1與自噬介導的α-syn清除的關聯(lián)。
　　研究結果：
　?。?）動物實驗結果發(fā)現 MPTP模型組與對照組在爬桿實驗、轉棒實驗和CatWalk步態(tài)分析方面都顯示出差異；陽性藥司來吉蘭（Sele）組與模型組相比，小鼠運動能力得到明顯恢復。MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H與MPTP組相比，行為學數據均有明顯改善，表現為小鼠爬至桿底所用時間較MPTP組顯著減少，在轉動的滾輪上持續(xù)跑動

8、的時間明顯增加，步態(tài)分析檢測顯示MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H組小鼠的運動軌跡規(guī)律性更加明顯，速度顯著提高，步頻增加，速度更加穩(wěn)定。而MPTP+GM1-H+3-MA組與MPTP+GM1-H相比，小鼠的運動能力的恢復又被逆轉。GM1-H組小鼠的行為學指標均與空白對照組沒有差異。
　?。?）細胞實驗中，顯微鏡下觀察 PD模型組細胞變得細長，內部出現空泡；給予40μM GM1后，細胞形態(tài)得到改善。Western Blot分析

9、檢測蛋白水平，發(fā)現GM1能夠明顯增加TH的水平，減少單體α-syn的水平。進一步的實驗發(fā)現，同自噬促進劑和抑制劑相比，GM1能夠增加自噬標記蛋白LC3II與LC3I的比例。GM1在濃度40μM和作用24小時時能最大程度促進正常SH-SY5Y細胞自噬量。串聯(lián)的熒光蛋白標記LC3，發(fā)現隨時間延長至24 h，GM1使綠色和紅色熒光蛋白的共定位明顯增加，紅色熒光蛋白也明顯增加。共聚焦顯微鏡下，發(fā)現 GM1能夠增加α-syn和LC3標記的自噬小體