自噬介導(dǎo)的α-突觸核蛋白降解在GM1緩解MPTP所致的帕金森病中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　帕金森?。≒arkinson’s Disease，PD）是多發(fā)于中老年人的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要的病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷和神經(jīng)元內(nèi)路易小體的出現(xiàn)。多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷是臨床診斷和治療帕金森病患者的重要依據(jù)，目前藥物治療的靶點(diǎn)也多數(shù)圍繞恢復(fù)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的水平，如抑制單胺氧化酶B、激動(dòng)多巴胺受體和抑制膽堿能神經(jīng)等；但基于改善多巴胺水平的臨床治療藥物并不能徹底治愈帕金森病，另一方

2、面，針對降解或清除路易小體的藥物還處于研究階段。異常聚集的α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）是路易小體的最主要成分，此蛋白在神經(jīng)元內(nèi)能夠調(diào)節(jié)突觸囊泡的循環(huán)、多巴胺的釋放、酪氨酸羥化酶（TH）的活性等，因此清除異常聚集的α-syn可能是治療帕金森病的潛在靶點(diǎn)。
　　神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）是臨床用于治療帕金森病的藥物。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)都證明GM1具有緩解帕金森病癥狀的效果，能夠修復(fù)受損的神經(jīng)元；但其具體的分子機(jī)

3、制仍需要進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)旨在探索GM1保護(hù)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病損傷的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　?。?）在動(dòng)物水平上評價(jià)GM1抗PD的藥效，同時(shí)觀察GM1與自噬的關(guān)聯(lián)
　　實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6小鼠，分組情況為：空白對照組、GM1高劑量組（GM1-H）、MPTP模型組、MPTP+GM1低劑量組（MPTP+GM1-L）、MPTP+GM1高劑量組（MPTP+GM1-H）、MPTP+3-MA+GM1高劑量組（MPTP+

4、GM1-H+3-MA）和MPTP+司來吉蘭組（MPTP+Sele），每組15只。除空白對照組和GM1高劑量組，其他小鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg/d），連續(xù)注射5天，建立帕金森病的亞急性動(dòng)物模型。MPTP造模5天后，根據(jù)組別連續(xù)兩周給予相應(yīng)的GM1、3-MA和Sele，空白對照組和MPTP組給予相應(yīng)的生理鹽水。GM1給藥方式為腹腔注射，低劑量為25 mg/kg/d，高劑量為50 mg/kg/d；3-MA給藥方式為腹腔注射，于GM

5、1給藥前30分鐘先注射，劑量15 mg/kg/d；Sele給藥方式灌胃，劑量為60 mg/kg/d。給藥結(jié)束后對小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的評價(jià)，包括爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和CatWalk步態(tài)分析，分別檢測小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。
　?。?）在細(xì)胞水平上探索GM1抗PD的作用機(jī)制
　　用MPTP的活性代謝產(chǎn)物MPP+造成SH-SY5Y細(xì)胞的帕金森病損傷模型。然后在MPP+損傷基礎(chǔ)上給予一系列濃度GM1（去掉含有MPP+的培養(yǎng)液，加入含有GM1的

6、培養(yǎng)液），觀察其對細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，最終選擇40μM GM1作用24小時(shí)。
　　使用顯微鏡觀察 GM1對 MPP+作用后細(xì)胞形態(tài)的影響，采用 Western Blot檢測GM1對PD模型細(xì)胞α-syn和酪氨酸羥化酶（TH）水平的影響，同時(shí)觀察GM1對自噬相關(guān)蛋白LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化作用的影響。采用Western Blot和激光共聚焦顯微鏡觀察GM1對正常SH-SY5Y細(xì)胞自噬量的影響。最后采用激光共聚焦顯微鏡觀察α-syn和

7、LC3標(biāo)記的自噬小體的共定位，以探索GM1與自噬介導(dǎo)的α-syn清除的關(guān)聯(lián)。
　　研究結(jié)果：
　?。?）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) MPTP模型組與對照組在爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和CatWalk步態(tài)分析方面都顯示出差異；陽性藥司來吉蘭（Sele）組與模型組相比，小鼠運(yùn)動(dòng)能力得到明顯恢復(fù)。MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H與MPTP組相比，行為學(xué)數(shù)據(jù)均有明顯改善，表現(xiàn)為小鼠爬至桿底所用時(shí)間較MPTP組顯著減少，在轉(zhuǎn)動(dòng)的滾輪上持續(xù)跑動(dòng)

8、的時(shí)間明顯增加，步態(tài)分析檢測顯示MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡規(guī)律性更加明顯，速度顯著提高，步頻增加，速度更加穩(wěn)定。而MPTP+GM1-H+3-MA組與MPTP+GM1-H相比，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)又被逆轉(zhuǎn)。GM1-H組小鼠的行為學(xué)指標(biāo)均與空白對照組沒有差異。
　?。?）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，顯微鏡下觀察 PD模型組細(xì)胞變得細(xì)長，內(nèi)部出現(xiàn)空泡；給予40μM GM1后，細(xì)胞形態(tài)得到改善。Western Blot分析

9、檢測蛋白水平，發(fā)現(xiàn)GM1能夠明顯增加TH的水平，減少單體α-syn的水平。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同自噬促進(jìn)劑和抑制劑相比，GM1能夠增加自噬標(biāo)記蛋白LC3II與LC3I的比例。GM1在濃度40μM和作用24小時(shí)時(shí)能最大程度促進(jìn)正常SH-SY5Y細(xì)胞自噬量。串聯(lián)的熒光蛋白標(biāo)記LC3，發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長至24 h，GM1使綠色和紅色熒光蛋白的共定位明顯增加，紅色熒光蛋白也明顯增加。共聚焦顯微鏡下，發(fā)現(xiàn) GM1能夠增加α-syn和LC3標(biāo)記的自噬小體