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1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> 對(duì)小鼠進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練,并且在6周后使用MPTP建立帕金森(PD)小鼠模型,觀察腦線粒體生物力能學(xué)、動(dòng)力學(xué)和自噬情況的發(fā)生,從線粒體自噬的角度研究運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)PD小鼠以上各項(xiàng)指標(biāo)的影響,并且研究其機(jī)制。
方法:
6周齡雄性C57BL/6小鼠40只,經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)及適應(yīng)性訓(xùn)練一周后,隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)組連續(xù)6周中等強(qiáng)度12米/分(75%VO2max)跑臺(tái)訓(xùn)練,每天20分鐘。然后以上兩
2、組再各自隨機(jī)分成兩組,分別注射生理鹽水或中等劑量MPTP,最后分為安靜+生理鹽水(N)、運(yùn)動(dòng)+生理鹽水(NE)、安靜+MPTP(M)、運(yùn)動(dòng)+MPTP(ME)四組,每組10只。各組分別于MPTP或生理鹽水注射后進(jìn)行行為學(xué)觀察(懸掛、爬桿、游泳)、黑質(zhì)細(xì)胞變化及免疫組織化學(xué)染色(灌注取材,石蠟切片,酪氨酸羥化酶檢測(cè))、透射電鏡觀察(腦神經(jīng)元內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)改變,線粒體自噬發(fā)生情況)、線粒體功能(提取腦線粒體、RCR、ATP合成速率等)、相關(guān)
3、蛋白表達(dá)(分子生物學(xué)方法觀察 Opa1,Drp1,Fis1,LC3-Ⅱ,Beclin1等蛋白及其mRNA在細(xì)胞內(nèi)含量)等的檢測(cè)。
結(jié)果:
(1)模型建立:行為學(xué)測(cè)試:本研究中發(fā)現(xiàn)中等劑量的MPTP使接受注射的兩組組小鼠在造模后第2天的三項(xiàng)測(cè)試的成績(jī)都顯著低于給藥前測(cè)試,并且在接下來(lái)的兩天中呈現(xiàn)上升趨勢(shì),運(yùn)動(dòng)和MPTP均可顯著性影響行為學(xué)測(cè)試結(jié)果,運(yùn)動(dòng)MPTP組小鼠的評(píng)分顯著性高于安靜MPTP小鼠(P<0.01);免疫
4、組化染色:經(jīng)過(guò)先期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的MPTP帕金森小鼠有更多中腦黑質(zhì)細(xì)胞幸存。
?。?)小鼠腦線粒體呼吸功能:中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高線粒體呼吸功能,運(yùn)動(dòng)MPTP組小鼠與安靜MPTP組和運(yùn)動(dòng)鹽水組小鼠的線粒體呼吸控制比(RCR)均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01),運(yùn)動(dòng)可以顯著影響態(tài)3呼吸。運(yùn)動(dòng)MPTP動(dòng)物的態(tài)3呼吸顯著高于安靜MPTP動(dòng)物(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)鹽水動(dòng)物比安靜鹽水動(dòng)物的態(tài)3呼吸顯著升高(P<0.05)。但態(tài)4沒(méi)有顯著性變化。
5、
?。?)線粒體ATP酶合成活力:安靜運(yùn)動(dòng)組小鼠腦線粒體ATP酶活力顯著性高于安靜鹽水組小鼠(P<0.05),并且運(yùn)動(dòng)和MPTP均能顯著影響小鼠腦線粒體ATP酶合成活力,且兩者之間有顯著性交互作用。
(4)Elisa測(cè)定小鼠腦GDNF含量:腦組織勻漿Elisa檢測(cè)運(yùn)動(dòng)MPTP組小鼠GDNF含量顯著高于安靜運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。其余組之間沒(méi)有顯著性差異,而血清中則各組間均沒(méi)有顯著性作用。
?。?)透射電鏡觀察線
6、粒體形態(tài)變化:注射MPTP組小鼠中腦黑質(zhì)出現(xiàn)大量脂滴,線粒體數(shù)量少,出現(xiàn)自噬泡且包含有線粒體,提示出現(xiàn)自噬現(xiàn)象;運(yùn)動(dòng)組小鼠中腦黑質(zhì)與安靜組相比中有部分脂滴,線粒體體積大數(shù)量多。
(6)蛋白及mRNA表達(dá)分析:Opa1:在接受MPTP注射的小鼠中,安靜組小鼠的融合蛋白顯著高于其它各組,其中,M組顯著高于N組及ME組(P<0.01);而在接受鹽水注射的小鼠中,N組也顯著性高于NE組(P<0.01)。Drp1:NE組小鼠腦線粒體Dr
7、p1蛋白顯著高于N組(P<0.05);M組小鼠腦線粒體Drp1蛋白顯著高于N組(P<0.05);Fis1:M組腦線粒體Fis1蛋白顯著比N組高(P<0.05),ME組小鼠腦線粒體Fis1蛋白顯著高于M組小鼠(P<0.05)。Beclin1:M組小鼠腦Beclin1比N組有顯著性升高(P<0.01);ME組小鼠與M組相比有顯著性升高(P<0.01);NE組小鼠與N組相比有顯著性升高(P<0.01);LC3-II:M組小鼠與N組相比有顯著性
8、升高(P<0.01);ME組與M組相比有顯著性升高(P<0.05);NE組與ME組有顯著性降低(P<0.01)。
結(jié)論:
1)中等劑量的MPTP誘導(dǎo)C57BL/6小鼠帕金森模型可以成功模擬人類散發(fā)性帕金森疾病的癥狀和過(guò)程,可以用于預(yù)防治療帕金森病機(jī)制的研究。
2)在MPTP致PD模型中,運(yùn)動(dòng)可以降低MPTP對(duì)小鼠力量及平衡能力的損傷,同時(shí)也促進(jìn)小鼠運(yùn)動(dòng)能力快速恢復(fù),延緩PD的病程并且減輕PD癥狀。推測(cè),其與
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