自噬在帕金森病増齡易感性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:自噬應(yīng)激參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷機(jī)制
　　目的:構(gòu)建C57BL小鼠1-甲基，4-苯基，1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl–4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）急毒模型，觀察帕金森?。≒arkinson disease，PD）小鼠中的自噬水平，并深入研究自噬在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:14mg/kg MPTP腹腔注射（1d內(nèi)分4次注射，每次間隔2h），構(gòu)

2、建C57BL小鼠MPTP急毒模型；同時(shí)采用雷帕霉素4mg/kg腹腔注射預(yù)處理給藥3次作為自噬誘導(dǎo)劑預(yù)處理組。在造模后第7d對各處理組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評定（小鼠爬桿檢測、小鼠轉(zhuǎn)棒耐力檢測）。免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠黑質(zhì)及紋狀體TH蛋白表達(dá)變化，透射電鏡觀察中腦黑質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。Western blot檢測中腦黑質(zhì) TH和α-synuclein蛋白表達(dá)變化，自噬特異性蛋白微管相關(guān)膜蛋白輕鏈3（microtubule-associated

3、protein light chain3，LC3）和自噬底物蛋白P62的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:（1）MPTP造模7d可引起小鼠爬桿時(shí)間延長，轉(zhuǎn)棒潛伏期縮短，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可緩解MPTP導(dǎo)致的小鼠行為學(xué)功能損傷。（2）MPTP造模7d后，小鼠黑質(zhì)及紋狀體 TH陽性細(xì)胞減少，且中腦黑質(zhì) TH蛋白表達(dá)顯著降低，α-synuclein表達(dá)增加，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可緩解MPTP導(dǎo)致的小鼠DA能神經(jīng)元損傷。（3）MPTP造模7d，小鼠中

4、腦黑質(zhì)可見線粒體腫脹損傷，同時(shí)可見雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)，而雷帕霉素預(yù)處理組可見較多的自噬體結(jié)構(gòu)和溶酶體。（4） MPTP造模7d小鼠中腦黑質(zhì)LC3-II蛋白表達(dá)增加，P62的表達(dá)也顯著增加；雷帕霉素預(yù)處理可進(jìn)一步上調(diào)LC3-II蛋白表達(dá)，同時(shí)減少P62蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論: MPTP引起的自噬應(yīng)激參與了PD小鼠的發(fā)病機(jī)制。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理可上調(diào)自噬水平，促進(jìn)自噬流完成，改善 MPTP引起的自噬功能障礙，促進(jìn)α-synucl

5、ein自噬降解從而對DA能神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。
　　第二部分:自噬在帕金森病増齡易感性中的作用
　　目的:構(gòu)建不同月齡C57BL小鼠MPTP急毒模型，觀察MPTP對不同月齡組PD小鼠的損傷作用，并研究自然増齡條件下自噬水平的變化及自噬在不同月齡PD小鼠發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:3月齡和16月齡C57BL小鼠，均分為生理鹽水對照組和PD模型組。在造模后第1、4、7天對各處理組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評定（小鼠爬桿檢測、小鼠轉(zhuǎn)棒

6、耐力檢測）。MPTP造模7d后免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠黑質(zhì)及紋狀體TH蛋白表達(dá)變化，透射電鏡觀察中腦黑質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，Western blot檢測中腦黑質(zhì)TH和α-synuclein蛋白表達(dá)變化，自噬特異性蛋白LC3、自噬底物蛋白P62和組蛋白去乙酰化酶6（Histone deacetylase6，HDAC6）蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:（1）與3月齡PD小鼠相比，16月齡PD小鼠在MPTP造模后1、4、7d爬桿時(shí)間均顯著延長

7、，且在MPTP給藥第7d具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期在不同月齡PD小鼠沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（2）MPTP造模后7d，與3月齡PD小鼠相比，16月齡PD小鼠黑質(zhì)和紋狀體TH陽性細(xì)胞的缺失較為明顯，TH蛋白表達(dá)也較低，α-synuclein的表達(dá)則顯著增加。（3）MPTP造模7d后16月齡小鼠中腦黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見較多的脂褐素沉積，線粒體腫脹空泡化，且可見較多的變性神經(jīng)元。（4）與3月齡生理鹽水對照組相比，16月齡生理鹽水對照組LC3-II

8、和HDAC6的表達(dá)下降，P62的表達(dá)增加。（4）MPTP造模7d后，與16月齡生理鹽水對照組相比，16月齡PD小鼠LC3-II、 P62和HDAC6的蛋白表達(dá)雖有增加但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；且與3月齡PD小鼠相比，16月齡PD小鼠LC3-II和HDAC6的蛋白表達(dá)顯著下降。
　　結(jié)論:老化可加劇DA能神經(jīng)元損傷，16月齡小鼠對MPTP誘導(dǎo)損傷存在較高的敏感性。小鼠中腦黑質(zhì)的自噬水平存在隨齡性下降趨勢。在3月齡小鼠中HDAC6介導(dǎo)的自噬應(yīng)

9、激可減弱MPTP引起的毒性作用，而16月齡小鼠的自噬失代償導(dǎo)致了老齡小鼠對MPTP毒性作用的増齡敏感性。
　　第三部分:帕金森病増齡易感性的自噬調(diào)控機(jī)制
　　目的:構(gòu)建不同月齡C57BL小鼠MPTP急毒模型，觀察自噬靶向藥物雷帕霉素和海藻糖對不同月齡組PD小鼠DA能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，并研究它們對不同月齡PD小鼠自噬的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:3月齡和16月齡C57BL雄性小鼠，均分為正常對照組、PD模型組、雷帕霉素溶劑

10、對照組、雷帕霉素高劑量組、雷帕霉素中劑量組、雷帕霉素低劑量組和海藻糖組。在造模后第7d對各處理組小鼠進(jìn)行小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)，透射電鏡觀察中腦黑質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。Western blot檢測中腦黑質(zhì)TH和α-synuclein蛋白表達(dá)變化，自噬特異性蛋白LC3、自噬底物蛋白P62、HDAC6蛋白及溶酶體相關(guān)膜蛋白1（Lysosome-associated membrane protein-1，LAMP1）的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:（1）高

11、、中、低三個(gè)不同劑量的雷帕霉素治療后，均可緩解3月齡和16月齡PD小鼠爬桿時(shí)間的延長，但雷帕霉素改善行為學(xué)的作用在3月齡PD小鼠與其劑量大小成反比。（2）高、中劑量雷帕霉素治療可誘導(dǎo)3月齡和16月齡PD小鼠中腦黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)形成自噬體。（3）雷帕霉素激活16月齡 PD小鼠自噬流和HDAC6的水平與其劑量大小成正比，高劑量的雷帕霉素治療3月齡PD小鼠雖可較高地上調(diào)LC3-II和HDAC6水平，但其誘導(dǎo)的自噬流功能卻并不是最強(qiáng)的。（4）不同劑量

12、雷帕霉素均可上調(diào)3、16月齡小鼠 LAMP1的表達(dá)，且此作用在3月齡PD小鼠與其劑量大小成反比。（5）1mg/kg海藻糖可通過激活自噬流和溶酶體，促進(jìn)α-synuclein自噬降解，進(jìn)而對3月齡PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但它對16月齡PD小鼠卻沒有作用。
　　結(jié)論:雷帕霉素和海藻糖治療能夠緩解3月齡PD小鼠的DA能神經(jīng)元損傷，其機(jī)制與誘導(dǎo)自噬流促進(jìn)α-synuclein自噬降解有關(guān)。在3月齡PD小鼠，鑒于低劑量雷帕霉素能夠協(xié)同上調(diào)