DNM1L蛋白介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬在鎘致肝臟毒性中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　鎘（Cadmium），是一種毒性非常大的工業(yè)和環(huán)境污染物。隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，重金屬元素鎘由于其在工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，對(duì)水源，土壤和農(nóng)產(chǎn)品的污染已經(jīng)給眾多地區(qū)的人民健康造成了巨大的危害。鎘具有很強(qiáng)的蓄積性，可因生物積累和生物放大對(duì)肝臟、腎臟等器官產(chǎn)生一系列損傷。目前，鎘已經(jīng)被美國(guó)毒性管理委員會(huì)列為第6位危害人類(lèi)健康的有毒物質(zhì)。鎘可以通過(guò)食物鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)移，也可以經(jīng)過(guò)呼吸道吸入，例如在生產(chǎn)與使用過(guò)程中的鎘粉塵及吸煙

2、時(shí)煙草中的鎘。線(xiàn)粒體是鎘損傷的重要細(xì)胞器之一。研究發(fā)現(xiàn)，鎘能夠引起線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)減少，呼吸鏈蛋白減少，線(xiàn)粒體質(zhì)量下降。但是這一機(jī)制目前仍然不是非常清楚。線(xiàn)粒體自噬是一種選擇性的自噬過(guò)程，是損傷線(xiàn)粒體降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和線(xiàn)粒體功能重要方法之一。但是過(guò)度的或者紊亂的線(xiàn)粒體自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體過(guò)度降解從而引起細(xì)胞能量代謝障礙，甚至細(xì)胞死亡。本課題在明確鎘引起的肝臟毒性效應(yīng)的條件下，研究鎘是如何引起線(xiàn)粒體丟失，揭示過(guò)度的線(xiàn)粒

3、體自噬在鎘致線(xiàn)粒體丟失中的重要作用;通過(guò)研究Ca2+-DNM1L介導(dǎo)的過(guò)度線(xiàn)粒體自噬，探討線(xiàn)粒體自噬在鎘毒性中的重要作用。
　　研究?jī)?nèi)容:
　?、僖訡CK-8實(shí)驗(yàn)等方法評(píng)價(jià)CdCl2對(duì)正常肝臟細(xì)胞株L02細(xì)胞的毒性效應(yīng);進(jìn)一步檢測(cè)CdCl2對(duì)線(xiàn)粒體質(zhì)量、ATP含量、線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ的蛋白含量以及線(xiàn)粒體DNA的拷貝數(shù)等反應(yīng)線(xiàn)粒體丟失的指標(biāo)的影響;在鎘暴露條件下，檢測(cè)L02細(xì)胞中自噬流的水平。通過(guò)蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白

4、LC3、SQSTM1蛋白水平。電鏡觀(guān)察自噬小體的水平。通過(guò)GFP-LC3與TOMM20共定位檢測(cè)含有線(xiàn)粒體的自噬小體，LysoTraker與MitoTraker共定位檢測(cè)含有線(xiàn)粒體的自噬溶酶體的變化。進(jìn)一步通過(guò)溶酶體活性抑制劑巴弗洛霉素A檢測(cè)鎘對(duì)自噬流的影響。最后，通過(guò)調(diào)控的線(xiàn)粒體自噬的關(guān)鍵基因ATG5，明確線(xiàn)粒體自噬在鎘致線(xiàn)粒體丟失中的重要作用。另外一方面，控制線(xiàn)粒體丟失另一重要環(huán)節(jié)線(xiàn)粒體生成，我們也檢測(cè)了調(diào)控線(xiàn)粒體生成的兩個(gè)核心蛋白

5、PPARGC1A和TFAM。
　?、谠阪k暴露條件下，通過(guò)檢測(cè)L02細(xì)胞線(xiàn)粒體的形態(tài)來(lái)衡量分裂-融合的動(dòng)態(tài)平衡明確鎘引起線(xiàn)粒體自噬的機(jī)制，檢測(cè)L02細(xì)胞中DNM1L、OPA1、MFN1、MFN2、FIS1等分子的表達(dá)變化，評(píng)價(jià)該調(diào)控軸的活化水平;并對(duì)DNM1L的表達(dá)進(jìn)行正負(fù)調(diào)控，檢測(cè)相應(yīng)的線(xiàn)粒體分裂-融合的動(dòng)態(tài)平衡，線(xiàn)粒體自噬的水平以及線(xiàn)粒體質(zhì)量的變化，驗(yàn)證DNM1L在鎘引起的線(xiàn)粒體丟失中的作用。同時(shí)，進(jìn)一步利用兩種檢測(cè)鈣水平的探針

6、，精確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣和線(xiàn)粒體內(nèi)鈣水平，并對(duì)兩種鈣離子水平分別進(jìn)行調(diào)控，以明確鎘是如何引起線(xiàn)粒體分裂-融合相關(guān)蛋白的變化的機(jī)制。
　?、垡訡57BL6/J小鼠腹腔注射可溶性鎘化合物氯化鎘(CdCl2)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，運(yùn)用DNM1L特異性抑制劑Mdivi-1進(jìn)行在體干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)ATP含量、線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ的蛋白含量研究鎘對(duì)小鼠肝臟線(xiàn)粒體丟失的影響。在小鼠出現(xiàn)肝臟功能改變的鎘暴露條件下，檢測(cè)DNM1L的水平和線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位情況，檢測(cè)線(xiàn)粒體利

7、用電鏡評(píng)價(jià)鎘對(duì)動(dòng)物肝臟線(xiàn)粒體形態(tài)的影響，蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物肝臟組織的線(xiàn)粒體中LC3和P62的水平，探討線(xiàn)粒體自噬在鎘的肝臟毒性效應(yīng)中的作用;
　　研究結(jié)果:
　?、貱dCl2對(duì)L02細(xì)胞造成顯著的線(xiàn)粒體丟失效應(yīng)，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系;鎘能夠引起線(xiàn)粒體質(zhì)量的下降，線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ的蛋白含量線(xiàn)粒體DNA的拷貝數(shù)減少，從而引起細(xì)胞的能量代謝障礙，導(dǎo)致肝臟的細(xì)胞毒性。CdCl2暴露引起L02細(xì)胞LC3蛋白的高表達(dá)，SQSTM1蛋

8、白的降解，含有線(xiàn)粒體的自噬小體和含有線(xiàn)粒體的自噬溶酶體的高表達(dá)，巴弗洛霉素A抑制后進(jìn)一步加劇了鎘引起的自噬水平，從而明確鎘能使肝臟細(xì)胞的自噬流增加。在暴露鎘的L02細(xì)胞中，抑制ATG5的表達(dá)，一定程度上緩解鎘引起的線(xiàn)粒體的丟失及細(xì)胞毒性;同時(shí)，介導(dǎo)線(xiàn)粒體丟失另一個(gè)重要環(huán)節(jié)，線(xiàn)粒體生成并沒(méi)有受到鎘的擾亂。
　?、贑dCl2暴露引起L02細(xì)胞線(xiàn)粒體分裂-融合的動(dòng)態(tài)平衡的紊亂，能夠顯著引起線(xiàn)粒體分裂增多，即長(zhǎng)條形和棒狀的線(xiàn)粒體變成了點(diǎn)狀

9、或球形的線(xiàn)粒體;同時(shí)，在精確控制線(xiàn)粒體分裂-融合的5種蛋白中，鎘暴露僅上調(diào)DNM1L的表達(dá)，增多的DNM1L蛋白會(huì)進(jìn)一步由胞漿向線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位;在暴露鎘的細(xì)胞中，抑制DNM1L的表達(dá)，一定程度上緩解鎘引起的過(guò)度的線(xiàn)粒體自噬的發(fā)生及線(xiàn)粒體的丟失，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài);同時(shí)，鎘暴露顯著引起細(xì)胞內(nèi)鈣和線(xiàn)粒體鈣水平的增高，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣能夠成功拮抗鎘誘導(dǎo)的DNM1L的表達(dá)及其線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位，抑制線(xiàn)粒體內(nèi)鈣只能夠拮抗DNM1L的轉(zhuǎn)位。
　?、? mg C

10、d/kg的CdCl2經(jīng)腹腔暴露引起C57BL6/J小鼠在暴露7天后肝臟出現(xiàn)的線(xiàn)粒體丟失和肝臟能量代謝障礙;CdCl2暴露7天后，小鼠肝臟組織中檢測(cè)到明顯的分裂的線(xiàn)粒體和過(guò)度的線(xiàn)粒體自噬的發(fā)生，然而利用DNM1L蛋白特異性活性抑制劑Mdivi-1，能夠顯著扭轉(zhuǎn)小鼠肝臟中鎘引起的過(guò)度線(xiàn)粒體自噬，降低線(xiàn)粒體蛋白COXⅣ蛋白的減少，維持肝臟細(xì)胞正常的能量代謝。
　　研究結(jié)論:
　　根據(jù)本課題的研究結(jié)果，獲得以下結(jié)論:鎘通過(guò)引起線(xiàn)粒體

11、的丟失，影響肝臟細(xì)胞的能量代謝，從而表現(xiàn)出肝臟毒性效應(yīng);鎘引起的過(guò)度的線(xiàn)粒體自噬而不是損傷了線(xiàn)粒體的生成可能是其造成線(xiàn)粒體丟失和肝臟細(xì)胞毒性的重要原因;鎘暴露引起Ca2+-DNM1L“調(diào)控軸”激活，由此造成的線(xiàn)粒體分裂-融合的動(dòng)態(tài)平衡的紊亂可能是鎘引起線(xiàn)粒體過(guò)度自噬的分子基礎(chǔ)。本研究闡述了Ca2+-DNM1L介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬在鎘致線(xiàn)粒體丟失及其肝臟毒性中的重要作用，通過(guò)了解DNM1L介導(dǎo)的線(xiàn)粒體分裂和線(xiàn)粒體自噬這一信號(hào)通路，為了解鎘的肝