AMPK-FOXO3A-BECN1介導(dǎo)的自噬在鎘暴露干細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　鎘(Cadmium)是自然環(huán)境和職業(yè)環(huán)境中常見(jiàn)毒物之一，其污染源主要來(lái)自于食物鏈傳遞和工業(yè)應(yīng)用，并且可通過(guò)非職業(yè)和職業(yè)暴露危害人群健康。骨是鎘重要的靶點(diǎn)，由于鎘能在體內(nèi)蓄積并且生物半衰期很長(zhǎng)，即使是低劑量持續(xù)暴露也會(huì)引起骨損傷。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種具有自我增殖能力的非造血干細(xì)胞，可以分化為成骨細(xì)胞。研究表明鎘可以通過(guò)影響間充質(zhì)干細(xì)胞活力從而抑制骨形成和影響骨組織的健康。自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的，并可通

2、過(guò)清除有害組織器官和細(xì)胞內(nèi)有毒大分子物質(zhì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的分解代謝途徑。然而，自噬也可以通過(guò)激活凋亡和抑制胞質(zhì)內(nèi)容物非特異性降解從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。哺乳動(dòng)物O類叉形頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXOs)有很多生物學(xué)功能，大量研究發(fā)現(xiàn)FOXO3a可能參與了自噬誘導(dǎo)過(guò)程，包括自噬小體形成和自噬相關(guān)基因表達(dá)。同時(shí)，AMPK可通過(guò)磷酸化FOXO3a特異性位點(diǎn)，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。因此，本課題研究的主要目的是探討鎘是否引起間充質(zhì)干細(xì)胞死亡及闡述其潛在機(jī)制。
　　研

3、究方法：
　　1.為了研究鎘暴露是否引起間充質(zhì)干細(xì)胞自噬性死亡，將間充質(zhì)干細(xì)胞用不同濃度氯化鎘(CdCl2)處理24h，或用14μM濃度CdCl2分別處理0，6，12，24h，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＠肅CK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估鎘暴露后細(xì)胞活力情況，并采用臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞死亡情況。通過(guò)共聚焦激光掃描顯微術(shù)評(píng)估鎘暴露后自噬小體形成情況，并用自噬抑制劑氯醛(chloroquine，CQ)檢測(cè)鎘暴露對(duì)自噬流的影響。在了解了自噬流變化的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一

4、步測(cè)定了鎘暴露后自噬相關(guān)基因表達(dá)情況。最后，通過(guò)抑制自噬關(guān)鍵基因BECN1表達(dá)及運(yùn)用自噬抑制劑3-MA的實(shí)驗(yàn)方法明確抑制自噬過(guò)程能否逆轉(zhuǎn)鎘暴露引起的間充質(zhì)干細(xì)胞自噬性死亡。
　　2.為進(jìn)一步研究鎘暴露引起間充質(zhì)干細(xì)胞死亡的具體機(jī)制，我們首先運(yùn)用蛋白印跡（Western blot，WB）、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)和免疫熒光(immunofluorescence)技術(shù)測(cè)定了FOXO家族

5、成員分子的表達(dá)情況并同時(shí)測(cè)定了上游分子AMPK的表達(dá)情況。然后，在明確相關(guān)分子表達(dá)的情況下，運(yùn)用基因沉默技術(shù)及AMPK特異性抑制劑化合物C(Compound C，CC)處理進(jìn)一步探討AMPK-FOXO3a信號(hào)通路是否參與了鎘引起的間充質(zhì)干細(xì)胞自噬性死亡。
　　研究結(jié)果：
　　1.鎘暴露降低了間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞活力并增加了細(xì)胞死亡數(shù)量，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。鎘處理引起GFP標(biāo)記的LC3小點(diǎn)增加，氯醛預(yù)處理進(jìn)一步加劇了鎘造成的自

6、噬流改變。再者，鎘暴露引起自噬相關(guān)基因包括BECN1，ULK1，ATG5和ATG12mRNA表達(dá)水平明顯增高，并呈時(shí)間和劑量依賴性。但是，只有BECN1蛋白表達(dá)水平和上述基因水平一致。進(jìn)一步干擾BECN1基因表達(dá)和運(yùn)用自噬抑制劑3-MA可以明顯減輕鎘造成的間充質(zhì)干細(xì)胞死亡。
　　2.鎘暴露后，F(xiàn)OXO1和FOXO3a基因和蛋白表達(dá)水平明顯增加，但是只有FOXO3a發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位。此外，鎘暴露可明顯增強(qiáng)FOXO3a轉(zhuǎn)錄水平，而對(duì)

7、FOXO1無(wú)明顯影響。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鎘暴露可以升高FOXO3a絲氨酸588位點(diǎn)和AMPK蘇氨酸172位點(diǎn)磷酸化水平，并呈劑量依賴關(guān)系。抑制AMPK基因表達(dá)或運(yùn)用AMPK特異性抑制劑化合物C處理可顯著降低鎘暴露引起的FOXO3a絲氨酸588位點(diǎn)磷酸化水平改變。最后，我們發(fā)現(xiàn)抑制FOXO3a基因表達(dá)可明顯減輕鎘誘導(dǎo)的BECN1和LC3表達(dá)及自噬小體形成情況。此外，運(yùn)用FOXO1和FOXO3a siRNA均能在一定程度上逆轉(zhuǎn)鎘暴露引起的間充質(zhì)

8、干細(xì)胞死亡。
　　研究結(jié)論：
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：
　　1.鎘暴露通過(guò)引起間充質(zhì)干細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)及自噬小體生成誘導(dǎo)發(fā)生自噬，抑制自噬關(guān)鍵基因BECN1的表達(dá)可以減輕鎘暴露引起的細(xì)胞死亡。
　　2.鎘暴露可以增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞FOXO3a和FOXO1表達(dá)。同時(shí)，鎘暴露增加AMPK表達(dá)水平，并通過(guò)磷酸化FOXO3a特異性位點(diǎn)（絲氨酸588位點(diǎn)）進(jìn)一步促進(jìn)FOXO3a發(fā)生核轉(zhuǎn)位并增加其轉(zhuǎn)錄水平。