AMPK-FOXO3A-BECN1介導的自噬在鎘暴露干細胞損傷中的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　鎘(Cadmium)是自然環(huán)境和職業(yè)環(huán)境中常見毒物之一，其污染源主要來自于食物鏈傳遞和工業(yè)應用，并且可通過非職業(yè)和職業(yè)暴露危害人群健康。骨是鎘重要的靶點，由于鎘能在體內(nèi)蓄積并且生物半衰期很長，即使是低劑量持續(xù)暴露也會引起骨損傷。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是一種具有自我增殖能力的非造血干細胞，可以分化為成骨細胞。研究表明鎘可以通過影響間充質(zhì)干細胞活力從而抑制骨形成和影響骨組織的健康。自噬是一種在進化上高度保守的，并可通

2、過清除有害組織器官和細胞內(nèi)有毒大分子物質(zhì)維持細胞穩(wěn)態(tài)的分解代謝途徑。然而，自噬也可以通過激活凋亡和抑制胞質(zhì)內(nèi)容物非特異性降解從而導致細胞死亡。哺乳動物O類叉形頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXOs)有很多生物學功能，大量研究發(fā)現(xiàn)FOXO3a可能參與了自噬誘導過程，包括自噬小體形成和自噬相關(guān)基因表達。同時，AMPK可通過磷酸化FOXO3a特異性位點，增強其轉(zhuǎn)錄活性。因此，本課題研究的主要目的是探討鎘是否引起間充質(zhì)干細胞死亡及闡述其潛在機制。
　　研

3、究方法：
　　1.為了研究鎘暴露是否引起間充質(zhì)干細胞自噬性死亡，將間充質(zhì)干細胞用不同濃度氯化鎘(CdCl2)處理24h，或用14μM濃度CdCl2分別處理0，6，12，24h，構(gòu)建實驗模型。利用CCK-8實驗評估鎘暴露后細胞活力情況，并采用臺盼藍實驗評估細胞死亡情況。通過共聚焦激光掃描顯微術(shù)評估鎘暴露后自噬小體形成情況，并用自噬抑制劑氯醛(chloroquine，CQ)檢測鎘暴露對自噬流的影響。在了解了自噬流變化的基礎(chǔ)上，我們進一

4、步測定了鎘暴露后自噬相關(guān)基因表達情況。最后，通過抑制自噬關(guān)鍵基因BECN1表達及運用自噬抑制劑3-MA的實驗方法明確抑制自噬過程能否逆轉(zhuǎn)鎘暴露引起的間充質(zhì)干細胞自噬性死亡。
　　2.為進一步研究鎘暴露引起間充質(zhì)干細胞死亡的具體機制，我們首先運用蛋白印跡（Western blot，WB）、聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)和免疫熒光(immunofluorescence)技術(shù)測定了FOXO家族

5、成員分子的表達情況并同時測定了上游分子AMPK的表達情況。然后，在明確相關(guān)分子表達的情況下，運用基因沉默技術(shù)及AMPK特異性抑制劑化合物C(Compound C，CC)處理進一步探討AMPK-FOXO3a信號通路是否參與了鎘引起的間充質(zhì)干細胞自噬性死亡。
　　研究結(jié)果：
　　1.鎘暴露降低了間充質(zhì)干細胞細胞活力并增加了細胞死亡數(shù)量，呈現(xiàn)時間-劑量依賴關(guān)系。鎘處理引起GFP標記的LC3小點增加，氯醛預處理進一步加劇了鎘造成的自

6、噬流改變。再者，鎘暴露引起自噬相關(guān)基因包括BECN1，ULK1，ATG5和ATG12mRNA表達水平明顯增高，并呈時間和劑量依賴性。但是，只有BECN1蛋白表達水平和上述基因水平一致。進一步干擾BECN1基因表達和運用自噬抑制劑3-MA可以明顯減輕鎘造成的間充質(zhì)干細胞死亡。
　　2.鎘暴露后，F(xiàn)OXO1和FOXO3a基因和蛋白表達水平明顯增加，但是只有FOXO3a發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位。此外，鎘暴露可明顯增強FOXO3a轉(zhuǎn)錄水平，而對

7、FOXO1無明顯影響。我們進一步發(fā)現(xiàn)鎘暴露可以升高FOXO3a絲氨酸588位點和AMPK蘇氨酸172位點磷酸化水平，并呈劑量依賴關(guān)系。抑制AMPK基因表達或運用AMPK特異性抑制劑化合物C處理可顯著降低鎘暴露引起的FOXO3a絲氨酸588位點磷酸化水平改變。最后，我們發(fā)現(xiàn)抑制FOXO3a基因表達可明顯減輕鎘誘導的BECN1和LC3表達及自噬小體形成情況。此外，運用FOXO1和FOXO3a siRNA均能在一定程度上逆轉(zhuǎn)鎘暴露引起的間充質(zhì)

8、干細胞死亡。
　　研究結(jié)論：
　　根據(jù)實驗研究結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：
　　1.鎘暴露通過引起間充質(zhì)干細胞自噬相關(guān)基因表達及自噬小體生成誘導發(fā)生自噬，抑制自噬關(guān)鍵基因BECN1的表達可以減輕鎘暴露引起的細胞死亡。
　　2.鎘暴露可以增強間充質(zhì)干細胞FOXO3a和FOXO1表達。同時，鎘暴露增加AMPK表達水平，并通過磷酸化FOXO3a特異性位點（絲氨酸588位點）進一步促進FOXO3a發(fā)生核轉(zhuǎn)位并增加其轉(zhuǎn)錄水平。