FoxO1介導的脂聯素信號受損在糖尿病心肌缺血-再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景：
　　高血糖或高血脂是糖尿病的標志，會導致心肌缺血/再灌注（MI/R）后心肌易損性的增加。糖尿病患者發(fā)生心肌缺血時，心肌細胞死亡數量、心功能損傷程度及再灌注后無復流現象較非糖尿病患者顯著增加。但是，糖尿病心肌缺血損傷加重，進而導致死亡率增高的機制尚未完全闡明。所以，闡明糖尿病MI/R損傷的分子機制至關重要，有望為防治糖尿病MI/R損傷提供新思路和新靶點。
　　脂聯素是主要由脂肪細胞分泌的一個細胞因子，主要發(fā)揮增強胰

2、島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化及心臟保護作用。脂聯素水平在肥胖相關疾病如冠狀動脈疾病和2型糖尿病時均顯著下降。而給予外源脂聯素或增加脂聯素的分泌均可通過增強胰島素敏感性降低血糖。近年來發(fā)表的一些文獻表明心肌細胞同樣可以合成和分泌脂聯素，認為心肌細胞分泌的脂聯素在保護缺血/再灌注(I/R)后心肌損傷方面發(fā)揮重要作用。
　　FoxO家族是近年來的一個研究熱點，參與多種生物反應過程，包括細胞周期，細胞死亡，分化，代謝，并且在胰島素信號

3、通路中發(fā)揮重要作用。FoxO1是FoxO家族中研究最多、作用最強的一種亞型。很多研究均表明糖尿病高甘油三脂血癥與FoxO1引起的葡萄糖和脂肪代謝失調密切相關。盡管有研究表明FoxO1可以促進脂肪組織脂聯素表達的增加，但其它研究結果證實在糖尿病時FoxO1會抑制促進脂聯素表達的PPARγ基因的表達，所以FoxO1對脂聯素表達的調節(jié)可能與病生理狀態(tài)、細胞類型和上游信號有關。因此我們設想：糖尿病時FoxO1的過度生成引起的脂聯素水平下降可能是

4、I/R后心肌損傷加重的重要原因。本研究擬對該假設進行驗證，進而闡明分子機制，為進一步闡明糖尿病I/R后心肌損傷加重的機制提供新的實驗依據。
　　研究目的：
　　1．建立糖尿病小鼠心臟 I/R模型，觀察糖尿病小鼠心臟組織是否存在FoxO1激活，FoxO1激活與糖尿病小鼠MI/R損傷加重是否有關；
　　2．在體心肌點注射FoxO1 siRNA抑制其表達，觀察脂聯素及其受體的變化以及MI/R損傷的變化，明確 FoxO1過度生

5、成在2型糖尿病MI/R后心肌易損性增強中的作用以及；
　　3．在高糖培養(yǎng)心肌細胞實驗中，觀察高糖作用下 FoxO1是否被激活；轉染FoxO1 siRNA后觀察脂聯素表達變化，以及SI/R后AdipoR1表達和細胞凋亡的變化。在細胞水平驗證MI/R時FoxO1對脂聯素及AdipoR1信號的調節(jié)作用及具體分子機制；
　　4．APN-/-小鼠心肌點注射FoxO1 siRNA，觀察MI/R損傷的變化，進一步驗證在糖尿病動物MI/R損

6、傷時，下調 FoxO1是否會通過逆轉脂聯素及其受體的下調，進而起到心臟保護的作用。
　　研究方法：
　　1．選取體重20-25g雄性C57B16/J小鼠，高脂飼料喂2 w，腹腔注射50mg/kg STZ，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)6 w，血糖≥10mmol/L認為糖尿病模型成功。
　　2.體內導入siRNA：2％異氟烷麻醉小鼠，消毒皮膚，擠出心臟，在預計動脈結扎部位下方用30G針頭心肌點注射 FoxO1 siRNA/RNAi-Mat

7、e復合物20μg/20μL，大約注射2-3個點。48小時后行MI/R。
　　3.小鼠 MI/R模型：用6-0絲線在小鼠冠脈左前降支中點處結扎，30 min后再灌注。再灌注3 h后檢測心肌細胞凋亡及相關蛋白表達，再灌注24 h后檢測心功能及心梗面積。假手術組采用同樣的方法處理，區(qū)別在于不結扎LAD。
　　4.乳鼠心肌細胞高糖培養(yǎng)（25mmol/L）24h后轉染FoxO1 siRNA/RNAi-Mate復合物，24h后行SI/R

8、。
　　5.心肌梗死面積測定：伊文氏藍/三苯四唑氯鹽（TTC）雙染色法。
　　6.心肌細胞凋亡檢測：①末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法；②Caspase-3活性測定（ELISA）。
　　7. Western-blot檢測FoxO1、脂聯素及AdipoR1蛋白水平。
　　8.實時定量PCR檢測FoxO1 mRNA水平。
　　實驗結果：
　　1.相較于正常小鼠，2型糖尿病小鼠

9、心肌FoxO1蛋白表達增加（P<0.05），而心肌來源的脂聯素（P<0.05）與AdipoR1表達減少（P<0.05）。同時，I/R后2型糖尿病小鼠心肌梗死面積增加（P<0.05）、心肌細胞凋亡增多及caspase-3活性進一步增加（P<0.05）。
　　2.給予心肌點注射 FoxO1 siRNA可以有效減少糖尿病小鼠過度生成的FoxO1 mRNA及蛋白（P<0.05）。而心肌FoxO1表達的下降促進心肌來源的脂聯素與AdipoR

10、1表達的恢復（P<0.05）。
　　3.抑制糖尿病小鼠心肌 FoxO1表達可明顯減少 MI/R后的心梗面積（P<0.05）、改善心功能（P<0.05），同時抑制心肌細胞凋亡（P<0.05）及caspase-3活性（P<0.05）。另外，與脂聯素變化一致，其下游 AMPK活性恢復。
　　4.相較于正常條件培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)的小鼠心肌細胞FoxO1 mRNA及蛋白表達增加（P<0.05），轉染FoxO1 siRNA可有效抑制FoxO

11、1 mRNA及其蛋白表達（P<0.05）。抑制 FoxO1表達可促進高糖條件下脂聯素水平的恢復（P<0.05），可促進高糖培養(yǎng)條件下SI/R后AdipoR1表達的恢復（P<0.05）以及心肌細胞凋亡的減輕（P<0.05）。
　　5. APN-/-小鼠心肌點注射 FoxO1 siRNA后可減少 FoxO1 mRNA表達（P<0.05），但抑制FoxO1表達對APN-/-小鼠MI/R損傷沒有顯著的保護作用。
　　結論：
　

12、　1.糖尿病小鼠較正常小鼠心肌FoxO1表達增高，而對MI/R損傷有保護作用的脂聯素與AdipoR1表達減少，提示FoxO1可能通過下調糖尿病心肌脂聯素信號加重MI/R損傷。
　　2.給予心肌點注射FoxO1 siRNA抑制FoxO1表達可減輕糖尿病MI/R損傷，同時心肌來源的脂聯素和AdipoR1表達恢復。進一步提示糖尿病狀態(tài)下FoxO1過度生成引起的脂聯素減少是引起糖尿病小鼠MI/R損傷加重的原因。
　　3.高糖培養(yǎng)的心