腎功能不全小鼠心肌缺血-再灌注損傷加重及機(jī)制：心肌脂聯(lián)素信號(hào)通路受損.pdf

1、研究背景:
　　慢性腎臟疾病是世界性的大眾健康問(wèn)題,其與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率升高密切相關(guān)。慢性腎臟疾病并發(fā)心血管疾病的危害日趨嚴(yán)重。慢性腎臟病患者心肌梗死的發(fā)生率是正常人的2倍。所以,防治慢性腎臟疾病對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷是必須解決的首要課題。
　　脂聯(lián)素是一種脂肪來(lái)源的30kDa細(xì)胞因子,具有降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)能量代謝、以及保護(hù)心血管的作用。脂聯(lián)素在血液中主要存在形式有:脂聯(lián)素三聚體、全長(zhǎng)脂聯(lián)素、高分子量脂聯(lián)素。在常見(jiàn)疾

2、病如:高血壓、冠心病等中,血清脂聯(lián)素水平較低。以往研究證實(shí):MI/R后脂聯(lián)素水平下降,且脂聯(lián)素通過(guò)減輕氧化/硝化應(yīng)激保護(hù)I/R心肌。然而,慢性腎功能不全患者血漿脂聯(lián)素水平升高,腎功能不全伴發(fā)的心血管并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率也明顯升高。到目前為止,脂聯(lián)素對(duì)慢性腎臟疾病并發(fā)心血管疾病的作用及機(jī)制沒(méi)有闡明。
　　研究目的:
　　⒈觀察腎功能不全小鼠動(dòng)物模型血、尿脂聯(lián)素的動(dòng)態(tài)變化及I/R對(duì)腎功能不全小鼠心肌的作用。
　　⒉闡明脂

3、聯(lián)素對(duì)腎功能不全小鼠I/R心肌的作用及機(jī)制。
　　研究方法:
　?、蹦I功能不全模型的建立:動(dòng)物麻醉后,切除左側(cè)2/3腎臟。完整保留腎上腺,將剩余的腎臟組織送回腹腔。動(dòng)物恢復(fù)2周后再次麻醉,完整切除右側(cè)腎臟。
　?、残∈笮募∪毖俟嘧⒛Ｐ偷慕?小鼠經(jīng)2％異氟烷麻醉后,用活結(jié)絲線(xiàn)結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈的前降支血管。30分鐘后解開(kāi)活結(jié),心肌再灌注3小時(shí)(心肌凋亡檢測(cè))或24小時(shí)(心功能檢測(cè))。小鼠心肌缺血再灌注后,用預(yù)先置入的絲

4、線(xiàn)再次結(jié)扎前降支,然后將2%伊文氏藍(lán)注入小鼠左心室。
　?、惩庠葱匝a(bǔ)充脂聯(lián)素方法:野生型小鼠和脂聯(lián)素敲除鼠部分腎切除術(shù)后立即給予隨機(jī)腹腔注射PBS或gAd(globular adiponectin,gAd)2μg/g,1次/天,連續(xù)7天。
　?、瓷瘷z驗(yàn):ELISA法檢測(cè)腎功能不全小鼠的血、尿脂聯(lián)素。第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)部分腎切除術(shù)后的血肌酐、尿肌酐、尿素氮、胱抑素、肌酐清除率和尿蛋白。
　　⒌心功能、心肌梗

5、死面積和心肌凋亡的檢測(cè):再灌注24小時(shí)后,小動(dòng)物超聲檢測(cè)心功能。TTC/伊文氏藍(lán)雙染檢測(cè)心肌梗死面積。TUNEL染色和caspase-3活性檢測(cè)評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡。
　?、禢O、硝基酪氨酸、超氧化物的檢測(cè):NO用硝酸還原酶法檢測(cè),硝基酪氨酸用ELISA法檢測(cè),超氧化物用光澤精法檢測(cè),DHE染色觀察心肌超氧化物。
　　⒎Western blot檢測(cè):Western blot檢測(cè)心肌中的eNOS、peNOS、iNOS、AdipoR

6、1、AdipoR2、pAMPK和AMPK。
　　⒏免疫組化:免疫組化觀察腎臟的脂聯(lián)素及心肌中硝基酪氨酸。
　　研究結(jié)果:
　?、背晒⒛I功能不全模型:5/6腎切除術(shù)后,血漿肌酐、尿素氮、胱抑素、尿蛋白升高,肌酐清除率下降。提示成功建立了腎功能不全模型。
　　⒉腎功能不全小鼠血、尿脂聯(lián)素水平升高,腎臟脂聯(lián)素減少:腎切除后術(shù)后24小時(shí)血脂聯(lián)素開(kāi)始降低,72小時(shí)達(dá)最低。1周后血漿脂聯(lián)素逐漸升高,直至升高至4周。腎切除

7、術(shù)后尿脂聯(lián)素持續(xù)升高,腎臟脂聯(lián)素減少。
　　⒊腎功能不全小鼠MI/R損傷增加:與WT假手術(shù)小鼠MI/R后相比,腎功能不全WT小鼠MI/R后心功能降低,心肌梗死面積增加,心肌凋亡增加。
　?、茨I功能不全APN-KO小鼠MI/R損傷明顯增加:與腎功能不全WT小鼠MI/R后相比,腎功能不全 APN-KO小鼠 MI/R后心功能明顯降低,心肌梗死面積明顯增加,心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。脂聯(lián)素治療的腎功能不全 WT小鼠和腎功能不全APN-K

8、O小鼠心功能改善、心肌梗死面積減少、心肌細(xì)胞凋亡減少。
　?、的I功能不全小鼠上調(diào)心肌中iNOS的表達(dá),增加NO的產(chǎn)生:腎功能不全WT小鼠心肌中NO增加,腎功能不全APN-KO小鼠心肌中NO明顯增加。究其原因在于:心肌中iNOS的表達(dá)上調(diào),peNOS表達(dá)減少。脂聯(lián)素治療后生成減少。
　?、赌I功能不全小鼠心肌中O2-和硝基酪氨酸增加,脂聯(lián)素治療后減少:腎功能不全WT小鼠心肌中O2-和硝基酪氨酸增加,腎功能不全APN-KO小鼠心肌

9、中O2-和硝基酪氨酸明顯增加,脂聯(lián)素治療后減少。
　?、纺I功能不全小鼠心肌中脂聯(lián)素受體表達(dá)的變化:腎功能不全 WT小鼠心肌中AdipoR1和pAMPK表達(dá)減少,腎功能不全APN-KO小鼠心肌中AdipoR1和pAMPK表達(dá)明顯減少,脂聯(lián)素治療后逆轉(zhuǎn)。AdipoR2表達(dá)沒(méi)有變化。
　　結(jié)論:
　　⒈慢性腎功能不全心肌I/R損傷敏感性增加與APN/AdipoR1/AMPK信號(hào)通路的下調(diào)和心肌氧化/硝化應(yīng)激增加有關(guān)。