1型糖尿病缺血-再灌注心肌易損性增加的新機(jī)制-脂聯(lián)素抵抗及低脂聯(lián)素血癥.pdf

1、背景
　　近些年來(lái)糖尿病發(fā)病率迅速增加，糖尿病患者缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率均遠(yuǎn)高于正常人群，心血管疾病預(yù)后很差。其中，1型糖尿病又名胰島素依賴型糖尿病，其原因是胰腺產(chǎn)生胰島素的功能遭到破壞，導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏，引起糖尿病。1型糖尿病約占糖尿病的10％，并每年以2-5％的速度增加。1型糖尿病是終身性疾病，好發(fā)于兒童和青少年，在美國(guó)18歲以下的青少年中，每300人中，就有一例1型糖尿病患者。
　　研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者和動(dòng)物

2、其細(xì)胞因子和新陳代謝發(fā)生改變。脂聯(lián)素（APN）是由脂肪細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子，血漿含量很高。脂聯(lián)素不僅具有抗炎，調(diào)節(jié)糖脂代謝等功能，還具有抗凋亡作用。越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，脂聯(lián)素是潛在的心血管疾病治療靶點(diǎn)，可通過(guò)激活其受體和下游AMPK信號(hào)以及抗氧化硝化等作用有效保護(hù)缺血/再灌注（I/R）心臟。研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素發(fā)揮其作用主要通過(guò)膜受體AdipoR1和R2,調(diào)節(jié)下游AMPK和PPAR信號(hào)通路。
　　肥胖相關(guān)疾病（如冠心病和2型糖尿

3、病），其血漿脂聯(lián)素水平下降，而與肥胖相關(guān)疾病不同，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)1型糖尿病血漿脂聯(lián)素水平升高，也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)1型糖尿病血漿脂聯(lián)素水平也是下降的。目前，關(guān)于1型糖尿病血漿脂聯(lián)素的變化水平尚無(wú)定論。大量的臨床試驗(yàn)表明，脂聯(lián)素水平較高的人群，其心血管發(fā)病率較低，發(fā)展為糖尿病的幾率也較低，血漿脂聯(lián)素水平還可預(yù)測(cè)2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)程度。此外，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)血漿脂聯(lián)素濃度與胰島素水平呈負(fù)相關(guān)。提高脂聯(lián)素表達(dá)或給予外源性脂聯(lián)素治療可明顯改善胰島素抵抗，降低

4、血糖。因此，脂聯(lián)素可能是與胰島素抵抗及糖尿病相關(guān)的關(guān)鍵因子之一，在糖尿病的治療方面具有良好的應(yīng)用前景。
　　2004年的一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，血漿脂聯(lián)素水平與心肌梗死發(fā)病率呈明顯的負(fù)相關(guān)。血漿脂聯(lián)素水平較高的男性，其心肌梗死的發(fā)病率極低。在動(dòng)物模型上，脂聯(lián)素基因敲除（ADN-/-）小鼠心肌缺血/再灌注損傷明顯加重，而給予外源性脂聯(lián)素治療則可改善心肌損傷程度。另已證實(shí)2型糖尿病人血漿脂聯(lián)素水平降低，其缺血性心臟病的發(fā)病率及心梗后死亡率明

5、顯增加。提示，血漿脂聯(lián)素水平不僅與糖尿病的發(fā)生有關(guān)，血漿脂聯(lián)素水平變化還可能是糖尿病患者缺血性心臟病發(fā)病率增加的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病病人比非糖尿病發(fā)生心血管事件的危險(xiǎn)性高4.5倍，而脂聯(lián)素水平較低時(shí)發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)增加，且糖尿病患者心肌易損性增加，故保護(hù)再灌注心肌對(duì)這些患者來(lái)說(shuō)有重要意義。目前關(guān)于1型糖尿病血漿脂聯(lián)素變化趨勢(shì)尚不一致。鑒于脂聯(lián)素具有保護(hù)心肌、內(nèi)皮等作用，闡明脂聯(lián)素與1型糖尿病心肌易損性增加的關(guān)系及機(jī)制無(wú)疑

6、對(duì)防治糖尿病性缺血性心臟病有重要意義。
　　在高脂血癥和肥胖模型上，有研究發(fā)現(xiàn)血漿脂聯(lián)素水平下降，其受體AdipoR1和R2表達(dá)也下降，從而降低了脂聯(lián)素作用的敏感性，影響脂聯(lián)素發(fā)揮其促進(jìn)脂肪酸氧化、降低血糖、改善胰島素抵抗等作用。例如，在高脂血癥大鼠中發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素受體R1和R2表達(dá)明顯下降，導(dǎo)致血管反應(yīng)性對(duì)脂聯(lián)素的反應(yīng)下降，引起脂聯(lián)素抵抗，然而，1型糖尿病模型是否存在脂聯(lián)素抵抗目前尚不明確。
　　因此，我們擬對(duì)如下問(wèn)題進(jìn)行研

7、究：①1型糖尿病血漿APN水平及心肌組織其受體表達(dá)是否變化，其時(shí)相特點(diǎn)為何，是否存在脂聯(lián)素抵抗或低脂聯(lián)素血癥；②如存在脂聯(lián)素抵抗或低脂聯(lián)素血癥，其對(duì)1型糖尿病I/R心肌易損性的影響及機(jī)制如何。如闡明這些問(wèn)題，可為深化認(rèn)識(shí)糖尿病心肌易損性及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并可能為防治糖尿病性I/R心肌損傷提供新策略和新靶點(diǎn)。
　　目的
　?。?）明確1型糖尿病小鼠不同糖尿病持續(xù)時(shí)間血漿脂聯(lián)素和心肌組織AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)變

8、化。
　　（2）探討不同糖尿病持續(xù)時(shí)間小鼠MI/R后的心肌損傷程度的變化，明確外源性脂聯(lián)素治療是否具有心肌保護(hù)作用。
　?。?）闡明氧化/硝化應(yīng)激在脂聯(lián)素保護(hù)1型糖尿病小鼠缺血/再灌注心肌中的作用。
　　方法
　?。?）小鼠缺血再灌注模型的建立：用6.0絲線在小鼠左前降支距根部2-3mm處打一活結(jié)，造成心肌缺血，30min后，將活結(jié)打開再灌注。再灌注3h心肌進(jìn)行凋亡相關(guān)檢測(cè)；再灌注24h心肌用于檢測(cè)心梗范圍。假手

9、術(shù)組給予相同方法處理，不同的是小鼠左前降支不行結(jié)扎。
　　（2）1型糖尿病模型的建立：20-25gSwiss小鼠，給予STZ（40mg/kg）腹腔注射，連續(xù)5天，剪尾檢測(cè)血糖，約5天后血糖水平>10mmol/L為模型建立成功。
　?。?）心肌凋亡檢測(cè)：ELISA試劑盒檢測(cè)心肌組織Caspase-3活性以及末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位平端標(biāo)記法（TUNEL）原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　?。?）心肌梗死范圍：伊文氏藍(lán)/

10、TTC雙染色法。
　?。?）血漿乳酸脫氫酶的測(cè)定：ELISA試劑盒檢測(cè)血漿乳酸脫氫酶。
　?。?）血漿脂聯(lián)素濃度：ELISA試劑盒檢測(cè)血漿脂聯(lián)素濃度。
　?。?）AdipoR1和AdipoR2表達(dá)檢測(cè)：Western-blot檢測(cè)心肌組織AdipoR1和AdipoR2表達(dá)，心肌組織用預(yù)冷至0°C的PBS（pH7.4）清洗后移入預(yù)冷的裂解液中并剪碎。組織勻漿后12,000×g4℃離心10min，取上清。BCA蛋白定量試劑

11、盒進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品行SDS-PGEA電泳，用半干電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。5％的脫脂奶粉室溫封閉1h。將PVDF膜和一抗一起孵育，4°C過(guò)夜；用TBST緩沖液漂洗，將膜與偶聯(lián)二抗37°C一起孵育1h（二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的山羊抗兔抗體），洗去所有未結(jié)合的二抗后，使用ECL-plus免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
　　(8)一氧化氮（NO）及其在體代謝產(chǎn)物（NO2和NO3），統(tǒng)稱為NOx，采用硝酸還

12、原酶法檢測(cè)。
　　(9)?O2￣生成采用熒光素增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法和原位二氫乙啶（DHE）染色法檢測(cè)。
　　(10)心肌ONOO-水平：采用ELISA試劑盒檢測(cè)。
　　結(jié)果
　?。?）與正常小鼠相比，1型糖尿病小鼠血漿脂聯(lián)素水平在發(fā)病1周增高（P<0.01），后隨著病程延長(zhǎng)，其水平下降，7周時(shí)出現(xiàn)低脂聯(lián)素血癥（P<0.05）。其受體AdipoR1在發(fā)病1、3周時(shí)下降（P<0.05），而后表達(dá)逐漸增高，7周時(shí)Adipo

13、R1表達(dá)較正常對(duì)照組增高（P<0.05）。
　?。?）與正常小鼠MI/R相比，1型糖尿病小鼠MIR后，心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡增加，表現(xiàn)為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例和Caspase-3活性增加（P<0.05），并且隨著糖尿病病程延長(zhǎng)，其心肌損傷加重。
　?。?）再灌注前給予1型糖尿病發(fā)病1周的小鼠腹腔注射脂聯(lián)素球狀片段治療，心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡無(wú)明顯變化，而給予AMPK激動(dòng)劑(AICAR)可明顯降低心肌梗死面積及心肌細(xì)胞

14、的凋亡（P<0.05versusDM1+MI/R組）。
　　（4）再灌注前給予1型糖尿病發(fā)病7周的小鼠腹腔注射脂聯(lián)素球狀片段和AICAR治療，心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡明顯減輕（P<0.05versusDM7+MI/R組）。
　?。?）與正常對(duì)照組相比，1型糖尿病小鼠隨著病程延長(zhǎng)，NOX生成增加。MI/R使其表達(dá)進(jìn)一步增加。
　?。?）與正常對(duì)照組相比，1型糖尿病小鼠隨著病程延長(zhǎng)心肌?O2￣生成增加，MI/R使其生成進(jìn)

15、一步增加。
　?。?）1型糖尿病小鼠心肌ONOO-生成顯著增加（P<0.05vs.WT+Sham組），MI/R使其生成進(jìn)一步增加（P<0.05vs.DM+Sham組）。
　　（8）1型糖尿病7周小鼠再灌注前10分鐘給予gAD和EUK134（ONOO-清除劑，5mg/kg）治療，可使心肌ONOO-生成降低，并可縮小MI/R后的心梗面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論
　　（1）1型糖尿病小鼠血漿脂聯(lián)素水平隨著病程延長(zhǎng)

16、，呈早期增高，晚期下降的趨勢(shì)。而受體AdipoR1表達(dá)則表現(xiàn)為早期表達(dá)降低，晚期升高。提示1型糖尿病小鼠早期可能存在脂聯(lián)素抵抗，晚期可能存在低脂聯(lián)素血癥。
　　（2）再灌注前補(bǔ)充外源性脂聯(lián)素球狀片段對(duì)1型糖尿病小鼠早期MI/R心肌損傷無(wú)保護(hù)作用，而AICAR可減輕MI/R后心肌損傷，提示早期AdipoR1的降低可能是脂聯(lián)素干預(yù)無(wú)保護(hù)作用的原因。
　?。?）再灌注前補(bǔ)充外源性gAD可減輕1型糖尿病小鼠晚期MI/R的心肌損傷，提