錨蛋白外翻誘發(fā)整合素αvβ3介導的巨噬細胞噬紅細胞作用.pdf

1、成熟的哺乳動物紅細胞沒有細胞核，缺乏合成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的能力，其活動所需的能量依靠葡萄糖的酵解來供給，細胞的結(jié)構相對簡單，是研究細胞膜結(jié)構及其功能比較理想的模型之一。人紅細胞的平均壽命約為100～120天，在此期間，一個紅細胞可在組織和肺臟之間往返大約5～10萬次。紅細胞大約有1/4的生命期需要擠過狹窄的毛細血管，完成氧和二氧化碳的裝卸。紅細胞的雙凹碟盤形可以很好的適應其所需要遭受的變形。經(jīng)過周期性的工作后，衰老的紅細胞主要被脾、肝、骨髓

2、等處的巨噬細胞吞噬分解。
　　 巨噬細胞對凋亡細胞的識別主要通過其表面的受體來進行的。巨噬細胞表面介導凋亡細胞識別及粘附的受體分子主要有玻璃粘連蛋白受體(整合素αvβ3)、磷脂酰絲氨酸受體、清道夫受體等。在對主要的紅細胞膜蛋白氨基酸序列進行分析研究時發(fā)現(xiàn)，α血影蛋白，錨蛋白和帶4.2蛋白都含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列。RGD序列可以和約11種整合素結(jié)合介導細胞內(nèi)或細胞間的粘附，從而調(diào)節(jié)細胞的遷移、分化和細胞凋亡。相關

3、報道中，更多提到的是RGD序列和整合素αvβ3之間的粘附。α血影蛋白和錨蛋白是保守性非常強的蛋白質(zhì)，在紅細胞結(jié)構和功能上具有舉足輕重的作用，因此，我們希望了解含有RGD序列的膜蛋白是否可以和整合素αvβ3發(fā)生相互作用，參與巨噬細胞對衰老或疾病紅細胞的識別。
　　 論文利用蛋白質(zhì)組學技術和流式細胞術等對紅細胞膜蛋白在紅細胞程序性死亡過程中介導細胞間的粘附行為進行了系統(tǒng)研究。首先通過Far-Western blot技術，證實了紅細胞

4、囊泡中含有RGD序列的紅細胞膜蛋白中的一種或兩種膜蛋白能與整合素αvβ3產(chǎn)生相互作用。然而，錨蛋白和α血影蛋白分子量比較接近，分別采用純化的錨蛋白和血影蛋白進行研究，結(jié)果證明錨蛋白可以單獨與整合素αvβ3結(jié)合?？紤]到免疫印跡實驗中含有的去垢劑可能對實驗結(jié)果準確性的影響，論文采用了生物磁珠技術進一步驗證了天然構象的蛋白質(zhì)與整合素間的結(jié)合能力，實驗結(jié)果表明，在生理條件下，錨蛋白和整合素之間仍然有結(jié)合能力。
　　 錨蛋白是紅細胞膜內(nèi)在

5、蛋白，只有當其位于細胞膜外側(cè)且RGD序列也暴露在蛋白質(zhì)表面時，才有可能被巨噬細胞表面的受體分子所識別。論文采用體外模擬實驗對錨蛋白在紅細胞死亡過程中暴露到紅細胞膜的表面的機制進行了研究，同時由于磷脂酰絲氨酸外翻是細胞程序性死亡過程中主要的“死亡信號”，對磷脂酰絲氨酸的外翻情況也做了相應的檢測。結(jié)果表明：在外加流體剪切力和鈣離子的共同作用下，磷脂酰絲氨酸和錨蛋白均可以外翻到紅細胞表面，但熒光信號分布的差異表明錨蛋白的外翻機制可能不同于磷脂

6、酰絲氨酸。為了驗證外翻的錨蛋白和整合素αvβ3的結(jié)合可以介導紅細胞和巨噬細胞的粘附，論文采用了抑制實驗，即用整合素αvβ3、annexinⅤ和錨蛋白封閉紅細胞膜上或巨噬細胞表面可能的結(jié)合位點后檢測紅細胞和巨噬細胞的粘附。結(jié)果表明，封閉相關結(jié)合位點可以顯著降低巨噬細胞和紅細胞粘附的數(shù)量，錨蛋白的外翻可能是一個新發(fā)現(xiàn)的衰老紅細胞識別機制。
　　 論文還對正常紅細胞和基因敲除小鼠模型(帶3蛋白、錨蛋白、帶4.2蛋白及原肌球調(diào)節(jié)蛋白基因

7、敲除小鼠模型)的紅細胞在程序性死亡過程中力學及流變學參數(shù)、錨蛋白和磷脂酰絲氨酸的外翻信號進行了檢測，對膜蛋白之間的相互作用及巨噬細胞對不同膜蛋白缺失的紅細胞識別能力的差異進行了研究。結(jié)果顯示，在紅細胞程序性死亡過程中，帶4.2蛋白和原肌球調(diào)節(jié)蛋白基因敲除小鼠模型紅細胞的變形能力受到的影響最大，也就是說，這兩種膜蛋白缺失后的紅細胞膜骨架結(jié)構的穩(wěn)定性相對最差。與正常紅細胞相比，帶3蛋白和錨蛋白基因敲除小鼠模型的紅細胞的力學及流變學特性也受到

8、一定的影響。然而，錨蛋白基因敲除小鼠模型的紅細胞中，缺乏調(diào)節(jié)區(qū)域的錨蛋白外翻比例最高；帶3蛋白基因敲除小鼠模型的錨蛋白外翻比例相對最低。這個研究結(jié)果表明，錨蛋白調(diào)節(jié)區(qū)域部分或全部被切除可能更有利于其外翻，帶3蛋白和錨蛋白的連接對錨蛋白的外翻有至關重要的作用。
　　 綜上所述，本學位論文研究首次發(fā)現(xiàn)了在體外模擬紅細胞程序性死亡的過程中，膜內(nèi)在蛋白--錨蛋白在鈣離子和流體剪切力的作用下會暴露在細胞膜的表面，且可以被巨噬細胞受體分子-

9、-整合素αvβ3識別。錨蛋白和整合素αvβ3介導的衰老紅細胞和巨噬細胞之間的粘附可能是一個新發(fā)現(xiàn)的衰老或疾病紅細胞識別機制。根據(jù)研究人員已發(fā)表的文獻及本論文的研究結(jié)果，我們推測錨蛋白的外翻步驟如下：
　　 1)剪切力作用造成細胞外鈣離子的大量涌入和紅細胞膜結(jié)構的囊泡化，刺激細胞膜的不規(guī)則性，紅細胞程序性死亡被觸發(fā)；
　　 2)細胞內(nèi)的鈣離子濃度達到約10μM時會激活鈣調(diào)節(jié)蛋白酶和其他一些依賴鈣離子存在的酶類；
　　

10、 3)鈣調(diào)節(jié)蛋白首先水解錨蛋白，將錨蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)域C末端切去約20 kDa，導致錨蛋白和帶3蛋白、血影蛋白的結(jié)合力減弱80％；
　　 4)紅細胞在血管中穿行不斷的遭受流體剪切力的作用，而被部分水解的錨蛋白和其他膜蛋白的結(jié)合力減弱，部分錨蛋白在24個彈簧結(jié)構的作用下被彈出磷脂雙分子層，RGD序列暴露在膜表面，從而介導巨噬細胞和衰老或疾病紅細胞的粘附。
　　 迄今為止，研究人員對紅細胞的成熟過程已有比較全面的了解，但紅細胞