整合素αvβ3介導(dǎo)的阿霉素—樹枝狀聚合物納米載藥系統(tǒng)的腫瘤靶向研究.pdf

1、本課題通過藥劑學(xué)、高分子材料學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)等手段的交叉應(yīng)用,首先以聚酰胺.胺樹枝狀聚合物(Polyamidoarnine dendrimer,PAMAM)為聚合物骨架材料,以聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)為高分子修飾劑,制各不同PEG化程度的PEG-PAMAM,然后將模型藥物阿霉素(Doxorubicin,DOX)通過酸敏感的順式烏頭酸酐(Cis-acotonic anhydride,CA)和非酸敏感

2、的丁二酸酐(Succinic anhydride)共價結(jié)合到PAMAM表面,制備PEG-PAMAM-DOX偶聯(lián)物納米載藥系統(tǒng),通過考察PEG化程度和DOX偶聯(lián)方式對載藥系統(tǒng)體內(nèi)外活性的影響,優(yōu)選出PEG化程度最高的,并通過順式烏頭酸酐偶聯(lián)DOX的PPCD32/1作進一步研究。為進一步提高PPCD的抗腫瘤活性,以相同分子量的雙功能PEG(MAL-PEG-NHS)代替單功能PEG,通過控制投料比制備與PPCD32/1的PEG化程度和載藥量相

3、近的主動靶向給藥系統(tǒng)RGD-PPCD,考察偶聯(lián)RGD多肽對PPCD的體內(nèi)外活性的影響,并探討其可能的機理。
　　第一章的主要內(nèi)容是PEG-PAMAM-DOX的合成和表征。首先以分子量為5000的MeO-PEG-NHS和4代PAMAM為起始原料,制備三種PEG化程度的PEG-PAMAM,分別為PEG-PAMAM4/1、16/1和32/1。通過1H-NMR峰面積歸一化法計算得到每個PAMAM分子表面共價結(jié)合了3.8、12.9和20.1

4、個PEG分子。分別采用TLC、UV、1H-NMR、FTIR、GPC等方法對三種PEG-PAMAM進行結(jié)構(gòu)確證和表征。接著通過酸酐的氨解反應(yīng)分別制備DOX的順式烏頭酸酐衍生物(CAD)和丁二酸酐衍生物(SAD),兩者經(jīng)過活化后分別與三種PEG化程度的PEG-PAMAM偶聯(lián),制備PPCD和PPSD。采用UV和GPC等方法對PPCD和PPSD(統(tǒng)稱PEG-PAMAM-DOX)進行表征,并測定粒徑和Zeta電位。各PEG-PAMAM-DOX的載

5、藥量在6.18-18.18％(wt.％),每個PAMAM分子表面偶聯(lián)約14個DOX分子,游離CAD/SAD的含量小于0.6％(mol％),粒徑均在納米級的范圍內(nèi),Zeta電位隨PEG化程度增加而降低,且PPSD的電位高于PPCD。
　　第二章對PEG-PAMAM-DOX的體內(nèi)外活性進行評價。酸敏感釋放實驗表明PPCD具有酸敏感特性,DOX的釋放程度和速度均隨著PEG化程度的增加以及pH值的降低而增加,PPSD則在各pH條件下均沒有

6、DOX釋放;以CathespinB模擬溶酶體的酶環(huán)境,釋放結(jié)果表明PPCD和PPSD均不能通過酶解釋放游離DOX。各PEG-PAMAM和PEG-PAMAM-DOX的溶血毒性均顯著降低。以SKOV-3和B16細胞為腫瘤細胞模型,PPCD對兩種細胞的毒性高于PPSD,且PPCD的細胞毒性隨PEG化程度的增加而增加。兩種細胞對PPCD和PPSD的攝取均隨PEG化程度的增加而降低。SKOV03細胞對PEG-PAMAM-DOX的攝取機理研究結(jié)果表

7、明PEG-PAMAM-DOX主要通過與細胞膜上的負電荷發(fā)生靜電相互作用,然后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞攝取。細胞內(nèi)分布研究證明了PPCD能在溶酶體酸性環(huán)境中釋放游離DOX進入細胞核,PPSD雖然也定位于溶酶體,但不能釋藥。
　　第二章的第二節(jié)進一步考察了各PEG-PAMAM-DOX的組織分布和藥效學(xué)。首先采用活體熒光成像實驗初步考察各PEG-PAMAM-DOX在荷SKOV-3腫瘤組織的分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤蓄積隨PEG化程度的增加而增加,P

8、PSD的蓄積高于PPCD。采用FLD-HPLC法測定在各組織中游離和結(jié)合的DOX濃度。DOX與PEG-PAMAM偶聯(lián)后,在血液中的滯留時間顯著延長,主要表現(xiàn)為AUC,T1/2β和MRT顯著增加,Vc和CL大大減小;組織分布特性也發(fā)生顯著改變,以總DOX計,PPSD4/1、PPSD16/1、PPSD32/1、PPCD4/1、PPCD16/1和PPCD32/1在腫瘤部位的AUC分別為DOX溶液劑組的16.6、51.4、75.8、11.6、2

9、1.9N37.5倍。以游離DOX計,PPCD在腫瘤部位AUC大于PPSD,PPCD32/1和16/1的游離DOX的AUC大于DOX溶液劑組,分別達N35.0和15.5h·μg/g。各PEG-PAMAM-DOX均能有效抑制腫瘤生長,延長小鼠的生存時間,其中PPCD32/1具有最強的抗腫瘤活性,接種21天后的抑瘤率達N87.4％,平均生存時間和中位生存期最長,生存期延長率最大。
　　第三章對抗腫瘤活性最大的PPCD32/1進一步用RG

10、D多肽修飾,制備主動靶向載藥系統(tǒng)。首先通過分子模擬的方法對所設(shè)計的環(huán)狀多肽RGDyC的受體親和力進行評估;在此基礎(chǔ)上通過雙功能的MAL-PEG-NHS分別偶聯(lián)靶向頭基RGDyC和載體PAMAM,制備RGD-PEG-PAMAM:最后將CAD偶聯(lián)到PAMAM表面得NRGD.PPCD。表征結(jié)果表明,RGD-PPCD中每個PAMAM分子表面偶聯(lián)有21.2個PEG分子、16.8個RGDyC分子和14.2個CAD分子,粒徑為17.02±0.13nm

11、,Zeta電位為2.31±0.15mV。RGD-PPCD與PPCD具有相近的PEG化程度、載藥摩爾數(shù)、粒徑和Zeta電位,可用于進一步研究考察偶聯(lián)RGD對PPCD體內(nèi)外活性的影響。
　　第四章評價TRGD-PPCD的體內(nèi)外活性。體外釋放研究證明了偶聯(lián)RGD對酸敏性幾乎沒有影響。以人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC作為腫瘤新生血管內(nèi)皮模型,SKOV-3和B16細胞為腫瘤細胞模型,進行細胞水平的研究。偶聯(lián)RGD進一步增強了PPCD對三種細胞的

12、毒性,HUVEC、SKOV03和B16細胞的IC50值分別從8.24μM、20.58μM和15.64μM降低至3.58μM、11.04μM和4.37μM。與PPCDN比,HUVEC細胞對RGD-PPCD的總攝取增加了1.57倍;SKOV-3細胞的總攝取和內(nèi)吞分別增加了1.32倍和1.58倍;B16細胞的總攝取和內(nèi)吞分別增加了1.38倍和1.85倍。攝取機理研究結(jié)果表明,RGD-PPCD主要通過非特異性的靜電相互作用和特異性的整合素αvβ

13、3與RGD多肽相互識別與三種細胞接觸,然后主要經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞被細胞攝取,內(nèi)吞過程均為肌動蛋白和微管蛋白參與的細胞運動,此外,RGD與整合素αvβ3形成的配體受體復(fù)合物也對內(nèi)吞起到促進作用。對RGD-PPCD的細胞內(nèi)定位研究結(jié)果表明,三種細胞攝取RGD-PPCD后均能將其遞送至溶酶體,且RGD-PPCD能在溶酶體的弱酸性條件下釋放游離DOX,進入細胞核。
　　采用活體熒光成像考察RGD-PPCD在SKOV-3荷瘤裸鼠的組織分布

14、,48h后RGD-PPCD在腫瘤組織的熒光強度為PPCD的1.52倍(P＜0.05),游離的RGDyK能顯著降低RGD-PPCD在腫瘤部位的熒光強度(P＜0.05),證實了RGD-PPCD在腫瘤蓄積的特異性。B16荷瘤小鼠的體內(nèi)藥動學(xué)實驗結(jié)果表明,RGD-PPCD的滯留時間比PPCD稍短。RGD-PPCD在腫瘤組織總DOX和游離DOX的AUC分別是PPCD的1.46倍和2.36倍;另一方面,RGD-PPCD除了能引起腫瘤細胞凋亡外,還能