多肽介導(dǎo)肝腫瘤靶向診斷與治療的納米載藥系統(tǒng).pdf

1、目前惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升，肝腫瘤是我國常見惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤發(fā)病順序中占第二位，每年新增病例超過30萬。肝腫瘤具有惡性度高、病情發(fā)展快、生存期短等特點(diǎn)。肝腫瘤死亡率很高，平均5年生存期患者的比例僅為14.4％。肝腫瘤的診斷和治療存在很多尚未解決的問題。早期肝腫瘤缺乏明顯的癥狀，采用目前臨床上常用造影劑，由于缺乏對腫瘤的特異性識(shí)別，很難在早期發(fā)現(xiàn)肝腫瘤。目前仍然只有早期小型肝腫瘤可手術(shù)切除治療，晚期肝腫瘤手術(shù)困難且術(shù)后高復(fù)發(fā)。藥

2、物是肝腫瘤治療中的重要手段，然而目前的抗腫瘤藥物腫瘤靶向性差、治療效果不佳、毒副作用大。迄今為止尚缺乏有效的治療藥物。
　　 靶向納米藥物技術(shù)在腫瘤的診斷和治療中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的臨床應(yīng)用前景。本文的目的是通過構(gòu)建多肽介導(dǎo)肝腫瘤靶向診斷與治療的納米載藥系統(tǒng)來解決上述肝腫瘤診斷與治療中存在的問題。
　　 肝腫瘤細(xì)胞活動(dòng)旺盛、迅速分裂生長，因而形成了腫瘤組織、細(xì)胞不同于正常組織、細(xì)胞的病理變化：新生血管結(jié)構(gòu)不完整，腫瘤

3、血管滲透滯留增強(qiáng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)[1-5]、無氧代謝、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生長失控和跨膜pH調(diào)節(jié)能力增加形成的腫瘤細(xì)胞外弱酸環(huán)境[6-10]、營養(yǎng)物質(zhì)大量需求形成的腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)受體的表達(dá)上調(diào)[11-20]。這些與正常組織不同的病理特征，為靶向納米遞藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、應(yīng)用提供了依據(jù)。
　　 本文針對肝腫瘤病理特征，(1)腫瘤血管滲透滯留增強(qiáng)，(2)腫瘤細(xì)胞外弱酸

4、環(huán)境；(3)表達(dá)上調(diào)受體，設(shè)計(jì)三種肝腫瘤靶向遞送的策略，并依次三種策略將全文分為三個(gè)部分共七章內(nèi)容：
　　 第一部分結(jié)合EPR效應(yīng)和腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境的策略一
　　 基于EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向的設(shè)計(jì)主要是將藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)在納米尺度，經(jīng)血液循環(huán)被動(dòng)靶向進(jìn)入腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)組織水平腫瘤靶向。
　　 而本文第一部分策略一是在納米遞送系統(tǒng)經(jīng)EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向進(jìn)入腫瘤組織后，結(jié)合腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境，實(shí)現(xiàn)從腫瘤組織向腫瘤細(xì)胞的靶

5、向。而基于腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境從腫瘤組織向腫瘤細(xì)胞的靶向則是來源于一種可在弱酸性條件下插入到細(xì)胞膜的多肽。
　　 pH敏感肽pH-Low-Insertion-Peptide(pHLIP)來源于細(xì)菌視紫紅質(zhì)的跨膜螺旋蛋白C，在弱酸性條件下(pH6-6.5)可插入細(xì)胞膜形成跨膜螺旋[21-24]。通過親水性高分子聚乙二醇：Polyethylene glycol(PEG)利用pHLIP修飾樹枝狀高分子聚賴氨酸Dendrigraft Po

6、ly-L-lysines(DGL)，合成腫瘤細(xì)胞靶向載體DGL-PEG-pHLIP。利用DGL-PEG-pHLIP攜載藥物設(shè)計(jì)納米載藥系統(tǒng)可通過EPR效應(yīng)和腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境下pHLIP的插入細(xì)胞膜作用實(shí)現(xiàn)腫瘤組織到腫瘤細(xì)胞的兩步靶向。本文第一章利用DGL-PEG-pHLIP攜載pH敏感熒光探針(BF2-chelated tetraarylazadipyrromethenes)，制備pH敏感熒光探針納米載藥系統(tǒng)。本文全新合成的pHLIP

7、修飾腫瘤細(xì)胞膜靶向pH敏感熒光探針納米載藥系統(tǒng)分別基于pH智能控制的電子轉(zhuǎn)移和酚羥基/酚鹽轉(zhuǎn)變兩種機(jī)理發(fā)射熒光，在正常組織中性pH下電子的共軛轉(zhuǎn)移無熒光，酸性條件下分子內(nèi)電子的共軛體系破壞從而開啟分子的近紅外熒光。pH敏感熒光探針熒光強(qiáng)度隨pH降低增強(qiáng)，pH6.0時(shí)熒光強(qiáng)度是pH7.4時(shí)的8倍。此外，該納米載藥系統(tǒng)具有水溶性和肝腫瘤細(xì)胞膜靶向性。本文第二章利用DGL-PEG-pHLIP制備了肝腫瘤靶向載基因納米載藥系統(tǒng)(Nanopart

8、icles，NP)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子Vascular Endothelial GrowthFactor(VEGF)是促進(jìn)腫瘤新生血管形成的重要因子[25]。小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)VEGF可有效抑制腫瘤新生血管形成[26，27]。DGL-PEG-pHLIP復(fù)合VEGF沉默質(zhì)粒(small hairpin RNA against VEGF，shVEGF)制備了肝腫瘤靶向載基因納米載藥系統(tǒng)pHLIP-NP/shVEGF。pHLIP-NP

9、/shVEGF具有良好的腫瘤靶向效率，肝腫瘤部位的濃集效率是未修飾納米載藥系統(tǒng)NP/shVEGF的4倍，具有高效的VEGF沉默效果，能夠有效抑制肝腫瘤新生血管的生成，從而顯著抑制腫瘤生長。
　　 第二部分結(jié)合EPR效應(yīng)和腫瘤細(xì)胞高表達(dá)受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向的策略二
　　 如策略一所述，EPR效應(yīng)被動(dòng)僅能實(shí)現(xiàn)組織水平腫瘤靶向，除了腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境，腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的受體可被用來作為靶點(diǎn)，通過在納米系統(tǒng)上修飾可以特異性結(jié)合

10、這些受體的配體，可實(shí)現(xiàn)從腫瘤組織向腫瘤細(xì)胞的靶向。而這需要受體的選擇和靶向頭基的引用。
　　 轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)受體(transferrin receptor，TfR)在肝腫瘤細(xì)胞表面表現(xiàn)為高表達(dá)[12，28]。目前，Tf被作為腫瘤靶向頭基廣泛應(yīng)用于腫瘤靶向納米載藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。但是內(nèi)源性高濃度Tf可能影響Tf修飾納米載藥系統(tǒng)的腫瘤靶向效率；而且Tf本身分子量大(80 kDa)，其化學(xué)修飾存在一定的難度。本文

11、第三章基于Tf作為靶向頭基介導(dǎo)腫瘤靶向遞送存在的局限性，考察通過噬菌體展示技術(shù)篩選出可特異性結(jié)合人TfR并內(nèi)吞入胞的分別含7和12個(gè)氨基酸的T7肽(HAIYPRH)和T12肽(THRPPMWSPVWP)作為靶向頭基的可能性[29]。
　　 評價(jià)樹枝狀高分子(polyamidoamine dendrimers，PAMAM)通過PEG修飾上述潛在靶向頭基制備的載體(PAMAM-PEG-T7、PAMAM-PEG-T12、PAMAM-P

12、EG-Tf)在高表達(dá)TfR腫瘤細(xì)胞上的攝取。在血漿高濃度Tf存在時(shí)PAMAM-PEG-Tf的攝取相比無Tf存在時(shí)明顯降低；而PAMAM-PEG-T7與無內(nèi)源性Tf存在時(shí)攝取更加顯著，這證明了TfR上與T7的結(jié)合位點(diǎn)和與Tf的結(jié)合位點(diǎn)不同[30]。T7有可能解決Tf作為靶向頭基介導(dǎo)腫瘤靶向遞送存在的局限性。本文基于策略二的部分選用T7作為腫瘤靶向頭基。
　　 本文第四章以PAMAM-PEG-T7共價(jià)連接二乙基三胺五乙酸(Dieth

13、ylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)，螯合Gd3+，形成肝腫瘤靶向磁共振造影劑納米載藥系統(tǒng)GdDTPA-PAMAM-PEG-T7。PAMAM-PEG-T7在肝腫瘤細(xì)胞上的攝取顯著高于PAMAM-PEG。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7的弛豫率是市售釓噴酸葡胺(GdDTPA)的2.2倍。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7對裸鼠皮下肝腫瘤增強(qiáng)效果是GdDTPA-PAMAM-PEG的2.9倍，GdD

14、TPA的4.1倍。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7能夠高效特異性靶向肝腫瘤、并延長顯像時(shí)間。
　　 PAMAM內(nèi)部含有大量疏水空腔，可包載疏水性藥物[31-35]。本文第五章以PAMAM-PEG-T7包載疏水性抗腫瘤藥物阿霉素(Doxombicm，DOX)，形成肝腫瘤靶向DOX納米載藥系統(tǒng)PAMAM-PEG-T7/DOX。PAMAM-PEG-T7/DOX粒徑大約在10 nm?；赑AMAM的空間構(gòu)象隨著pH從中性至酸性呈現(xiàn)

15、敏感變化[36]，PAMAM-PEG-T7/DOX中DOX在微酸環(huán)境中快速釋放，而在中性條件下基本穩(wěn)定。PAMAM-PEG-T7/DOX顯著增加了肝腫瘤細(xì)胞對DOX的攝取。內(nèi)源性Tf的存在顯著降低PAMAM-PEG-T7/DOX對肝腫瘤細(xì)胞的IC50。PAMAM-PEG-T7/DOX在皮下肝腫瘤部位的濃集效率是PAMAM-PEG/DOX的1.7倍，游離DOX的5.3倍，顯示出良好的腫瘤生長抑制效果。
　　 利用DOX可插入到基因

16、雙鏈中形成穩(wěn)定復(fù)合物的特性[37，38]，本文嘗試了基因藥物和DOX的聯(lián)合給藥。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子，能夠特異性與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)凋亡，但不殺傷正常細(xì)胞[39，40]；同時(shí)DOX可顯著提高TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效率[4]。本文第六章采用TRAIL蛋白編碼質(zhì)粒(anexpression vector co

17、ntaining TRAIL open reading frame，pORF-hTRAIL)作為基因藥物，將DOX插入到pORF-hTRAIL，形成pORF-hTRAIL-DOX復(fù)合物，以PAMAM-PEG-T7通過靜電作用復(fù)合pORF-hTRAIL-DOX復(fù)合物，形成肝腫瘤靶向載TRAIL基因DOX納米載藥系統(tǒng)PAMAM-PEG-T7/pORF-hTRAIL-DOX，多靶點(diǎn)不同機(jī)制聯(lián)合治療肝腫瘤。每個(gè)pORF-hTRAIL分子可以攜載

18、約375個(gè)DOX分子。PAMAM-PEG-T7/pORF-hTRAIL-DOX相比未修飾組在肝腫瘤細(xì)胞上的攝取、基因藥物表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果更為顯著。同時(shí)，DOX的給藥劑量降低約30倍，可達(dá)到比臨床劑量DOX更好的腫瘤生長抑制效率。
　　 第三部分結(jié)合EPR效應(yīng)、腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境和主動(dòng)靶向的策略三
　　 TfR不僅在腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)[42-44]，在正常組織細(xì)胞如肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞等的表面都有表達(dá)，甚

19、至在腦細(xì)胞表面也有表達(dá)[45]。因此，在利用T7介導(dǎo)增加藥物腫瘤細(xì)胞靶向濃集的同時(shí)，可能導(dǎo)致正常細(xì)胞的藥物蓄積，引發(fā)不必要的毒副作用。綜合考慮腫瘤組織和正常組織的病理、生理差異，本文第七章設(shè)計(jì)了基于EPR效應(yīng)、腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境響應(yīng)和主動(dòng)靶向相結(jié)合的，腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境控制開啟的主動(dòng)靶向納米載藥系統(tǒng)。采用親水、負(fù)電的DTPA分子通過腙鍵改裝T7肽末端，合成DTPA改裝載體(DGt-PEG-T7-hydrazone-DTPA，DPThD)

20、。在正常組織，T7肽被DTPA所隱蔽，不能被TfR識(shí)別、結(jié)合并介導(dǎo)入胞。而在腫瘤組織，腫瘤微酸環(huán)境下腙鍵斷裂水解，T7肽顯露出來并特異性識(shí)別結(jié)合。YfR介導(dǎo)入胞。此外，DTPA的親水性，還可以大大降低補(bǔ)體系統(tǒng)的識(shí)別，延長納米載藥系統(tǒng)在血液中的循環(huán)時(shí)間。鈣粘蛋白(Cadherin17，CDH17)與肝腫瘤轉(zhuǎn)移息息相關(guān)[46]。CDH17沉默質(zhì)粒(small hairpin RNA against CDH17，shCDH17)作為基因藥物，