葉酸和核定位信號介導(dǎo)載藥納米膠束的腫瘤細胞靶向作用研究.pdf

1、為提高聚合物膠束抗腫瘤的主動靶向能力，本課題以膽固醇疏水改性殼聚糖(CHGC)為基本骨架，表面飾以葉酸和(或)NLS，得到新型納米膠束，并以疏水性阿霉素為模型藥物、香豆素6為探針，來研究其體外細胞作用。
　　 目的：研究葉酸修飾的納米膠束的體外細胞毒性、細胞攝取。研究核定位信號修飾的納米膠束的體外細胞毒性、細胞攝取和細胞核轉(zhuǎn)運方式。研究葉酸和核定位信號修飾的納米膠束的體外細胞毒性、細胞攝取、內(nèi)體溶酶體逃逸能力和細胞核轉(zhuǎn)運方式。<

2、br>　　 方法：應(yīng)用乳化.溶劑揮發(fā)法制備載阿霉素葉酸修飾納米膠束，并研究其理化性質(zhì)；采用MTT法檢測載阿霉素納米膠束對A549細胞和HeLa細胞產(chǎn)生的毒性作用；激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和流式細胞儀(FCM)觀察HeLa細胞對葉酸修飾的納米膠束的攝取行為。應(yīng)用乳化-溶劑揮發(fā)法制備載阿霉素核定位信號納米膠束，并研究其理化性質(zhì)；采用MTT法檢測載阿霉素納米膠束對HeLa和MCF-7/ADR細胞的毒性作用；激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和

3、流式細胞儀(FCM)觀察載阿霉素納米膠束在HeLa細胞的分布；應(yīng)用內(nèi)吞抑制劑(鹽酸阿米洛利、鹽酸氯丙嗪和染料木素)考察其對載阿霉素納米膠束入胞方式的影響；CLSM觀察WGA對DNCFtGC納米膠束在HeLa細胞內(nèi)的入核影響。應(yīng)用乳化.溶劑揮發(fā)法制備載阿霉素和載香豆素6納米膠束，并研究其理化性質(zhì)；采用MTT法檢測載阿霉素納米膠束對A549細胞和KB細胞毒性作用；激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和流式細胞儀(FCM)觀察載香豆素6納米膠束在KB

4、細胞的分布和攝取作用；應(yīng)用內(nèi)吞抑制劑(鹽酸阿米洛利、鹽酸氯丙嗪和染料木素)考察其對載香豆素6納米膠束入胞方式的影響；CLSM觀察CNFCHGC-3納米膠束在KB細胞內(nèi)體.溶酶體中的逃逸狀況，以及WGA和NEM對CNFCHGC-3納米膠束在KB細胞內(nèi)入核的影響。
　　 結(jié)果：制備了載阿霉素DCHGC-1和DFCHGC-1膠束，兩種膠束的體外釋放行為均呈兩相模式，平均粒徑分別為251 nm、266 nm。HeLa細胞48 h毒性實驗

5、顯示，葉酸修飾的載藥膠束的毒性作用強于游離阿霉素和未接葉酸的納米膠束，游離阿霉素的IC50分別是DCHGC-1和DFCHGC-1納米膠束的2.1倍和5.4倍；A549細胞48 h毒性實驗顯示，游離阿霉素的IC50分別是DCHGC-1和DFCHGC-1納米膠束的2.4倍和1.5倍。載阿霉素納米膠束與HeLa細胞共孵育0.5 h和4 h后，CLSM結(jié)果表明，葉酸修飾的納米膠束可以介導(dǎo)更多藥物進入葉酸受體表達豐富的HeLa細胞。內(nèi)吞抑制劑處理

6、后，CLSM結(jié)果說明DFCHGC-1的細胞攝取以吞噬作用和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)為主要途徑。制備載阿霉素DCHGC-2和DNCHGC-2膠束，其藥物體外釋放均呈兩相模式，平均粒徑分別為246 nm、248 nm。HeLa細胞48h毒性實驗顯示，核定位修飾的載藥膠束的毒性作用強于游離阿霉素和未經(jīng)修飾的納米膠束，游離阿霉素的IC50分別是DCHGC-2和DNCHGC-2納米膠束的2.3倍和7.0倍；MCF-7/ADR細胞48 h毒性實驗顯示，游離阿霉

7、素的IC50分別是DCt-IGC.2和DNCHGC-2納米膠束的3.5倍和13.5倍。載阿霉素納米膠束與HeLa細胞共孵育4h，內(nèi)吞抑制劑處理后，F(xiàn)CM和CLSM結(jié)果表明，NLS修飾的納米膠束能夠進入細胞核，并主要通過小窩蛋白途徑和吞噬途徑進入細胞。WGA處理后，DNCHGC-2與HeLa細胞共孵育1 h，CLSM結(jié)果表明，DNCHGC-2在HeLa細胞其入核過程主要通過核定位信號途徑，不是糖蛋白途徑。制備葉酸和核定位修飾的載阿霉素納米

8、膠束和載香豆素6納米膠束，載阿霉素納米膠束體外釋放呈兩相模式。KB細胞48 h毒性實驗表明，葉酸和核定位修飾的載阿霉素納米膠束的毒性作用強于游離阿霉素、葉酸修飾的納米膠束、NLS修飾的納米膠束和未經(jīng)修飾的納米膠束，游離阿霉素的IC50.分別是DCHGC-3、DFCHGC-3、DNCHGC-3和DNFCHGC-3納米膠束的1.7倍、16.1倍、10.0倍和27.1倍；A549細胞48h毒性實驗表明，游離阿霉素的IC50分別是DCHGC-3

9、、DFCHGC-3、DNCHGC-3和DNFCHGC-3納米膠束的2.9倍、1.5倍、3.1倍和1.7倍。載香豆素6納米膠束與KB細胞共孵育4h，CLSM和FCM結(jié)果都表明，葉酸和NLS雙重修飾載香豆素6納米膠束具備提高載香豆素6膠束靶向進入細胞漿，細胞核的能力。內(nèi)吞抑制劑處理后，F(xiàn)CM和CLSM結(jié)果表明，CNFCHGC-3在KB細胞攝取主要通過小窩蛋白介導(dǎo)途徑進入細胞，2 h主要分布在內(nèi)體.溶酶體，4 h出現(xiàn)在胞漿中，6h胞漿明顯同時

10、分布于細胞核。核轉(zhuǎn)運抑制劑處理后，CNFCHGC-3與KB細胞共孵育1h，CLSM結(jié)果表明，CNFCHGC-3在KB細胞其入核過程主要通過核定位信號途徑，不是糖蛋白途徑。
　　 結(jié)論：葉酸修飾的納米膠束能顯著提高藥物在葉酸表達豐富的腫瘤內(nèi)的細胞毒性，具備介導(dǎo)藥物靶向入胞的能力。核定位信號修飾的納米膠束能提高藥物進入細胞核的能力和細胞毒性作用，具備介導(dǎo)藥物靶向入核能力。葉酸和核定位信號修飾后的納米膠束能明顯提高藥物的細胞毒性作用，