受體介導(dǎo)的葉酸-牛血清白蛋白腫瘤細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見病和多發(fā)病。已有研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在多種腫瘤(如卵巢癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和腎細(xì)胞癌等)細(xì)胞膜上高度表達(dá)，而在正常組織上低表達(dá)甚至不表達(dá)。因此可利用葉酸受體與配體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)化，將藥物攝取入真核細(xì)胞胞漿，增加藥物在病灶局部的濃度，降低毒副作用，達(dá)到靶向治療目的。 本課題以長(zhǎng)春新堿(VCR)作為模型藥物，牛血清白蛋白(BSA)為載體材料，葉酸(FA)為靶頭，制備葉酸受體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)

2、胞靶向給藥系統(tǒng)。 首先采用去溶劑化-交聯(lián)法制備長(zhǎng)春新堿的牛血清白蛋白納米粒(VCR-BSA-NP)，以VCR在納米粒中的包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到優(yōu)化處方與制備工藝(VCR與BSA的濃度比1:20、溶液pH=7，戊二醛體積0.075ml，固化時(shí)間10h)。優(yōu)化工藝所制備的納米粒包封率穩(wěn)定；呈類球形體，表面光滑，平均粒徑為200nm；成球率較高，絕大部分的輔料BSA能形成微粒；釋藥過程呈現(xiàn)一定的緩釋效果，但是前期有個(gè)突

3、釋階段；長(zhǎng)期放置，則穩(wěn)定性不太好。 根據(jù)FA偶聯(lián)至BSA上的時(shí)機(jī)不同，分別制備了兩種類型的VCR-FA-BSA-NP。Ⅰ型為在載體成球前連接配體，即先將FA偶聯(lián)至BSA表面，然后由FA-BSA制備VCR-FA-BSA-NP；Ⅱ型為在載體成球后連接配體，即先制備VCR-BSA-NP，然后再將FA偶聯(lián)至BSA上。經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)：Ⅱ型微粒較Ⅰ型微粒分布更均勻且粒徑稍小，Ⅰ型微粒約為250nm，Ⅱ型微粒則約為210nm；Ⅰ型微粒的葉酸偶聯(lián)

4、率(76.18μg/mg)明顯高于Ⅱ型微粒的葉酸偶聯(lián)率(65.09μg/mg)；Ⅰ型微粒的包封率(84.97％)與Ⅱ型微粒的包封率(87.01％)相當(dāng)，沒有明顯差別；Ⅰ型VCR-FA-BSA-NP在釋藥初期有一定程度的突釋，隨后較平緩，而Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP則一直釋放平緩。 采用MTT法評(píng)價(jià)牛血清白蛋白載藥納米粒(VCR-BSAμN(yùn)P)、葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白載藥納米粒(VCR-FA-BSA-NP)和長(zhǎng)春新堿原料藥(VC

5、R)對(duì)人子宮頸癌HeLa細(xì)胞、人結(jié)腸癌CaCo-2細(xì)胞和猴腎細(xì)胞COS-1的細(xì)胞毒性。試驗(yàn)結(jié)果顯示：各型VCR藥劑對(duì)三種細(xì)胞的毒性均有差異，且都表現(xiàn)出顯著的濃度依賴性，藥物濃度越大則毒性越強(qiáng)；對(duì)于Hela細(xì)胞和CaCo-2細(xì)胞，各型VCR藥劑的細(xì)胞毒程度依次為VCR＜VCR-BSA-NP＜Ⅰ型VCR-FA-BSA-NP＜Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP，其中Ⅰ、Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP的細(xì)胞毒性卻差異不大；游離VCR藥物對(duì)正常細(xì)胞也

6、具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而BSA-VCR-NP并沒有改善這種對(duì)正常細(xì)胞的抑制殺傷作用，但是Ⅰ、Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP對(duì)COS-1細(xì)胞的抑制率卻較VCR-BSA-NP明顯改善；FA的引入使得載體連接的FA和腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合產(chǎn)生一定的靶向作用，導(dǎo)致了更多腫瘤細(xì)胞被殺傷，因此VCR-BSA-NP對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性明顯增強(qiáng)，并且Hela細(xì)胞的藥敏性比CaCo-2細(xì)胞的藥敏性強(qiáng)。 用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記牛血清白蛋白和

7、葉酸偶聯(lián)的牛血清白蛋白，以正常的猴腎細(xì)胞COS-1及表面表達(dá)有葉酸受體的人子宮頸癌HeLa細(xì)胞、人結(jié)腸癌CaCo-2細(xì)胞為模型細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞攝取機(jī)理研究。熒光倒置顯微鏡結(jié)果表明，F(xiàn)A-BSA-NP對(duì)腫瘤細(xì)胞具有主動(dòng)靶向作用，細(xì)胞對(duì)它的攝取是通過腫瘤細(xì)胞表面豐富的葉酸受體介導(dǎo)產(chǎn)生的，而且由于受體-配體結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，F(xiàn)A-BSA-NP的主動(dòng)靶向性也可以被游離FA顯著抑制甚至完全被阻斷從而回歸到BSA-NP的狀況。 葉酸受體