葉酸介導(dǎo)眼部靶向給藥體系構(gòu)建及表征.pdf

1、目的:分析視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Y-79、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19中葉酸受體的表達(dá)差異，探討其與病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步研究靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤藥物載體奠定基礎(chǔ)。殼聚糖是一種優(yōu)良的醫(yī)用生物材料，可與靶向藥物或含雙官能團(tuán)的醛化學(xué)偶聯(lián)，制成前體藥物制劑，以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，增強(qiáng)藥效。本課題制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒，以實(shí)現(xiàn)局部給藥，藥物緩釋，同時(shí)改善抗腫瘤藥物在眼內(nèi)的生物利用度，為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療拓展了新途徑。
　　方法:

2、實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行葉酸受體表達(dá)的檢測(cè)，采用Trizol法提取Y-79細(xì)胞、APRE-19細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)兩樣品中葉酸受體的mRNA表達(dá)情況;運(yùn)用Western blot方法檢測(cè)葉酸受體在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。接著采用接枝共聚法制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒，通過(guò)將葉酸制備成葉酸活性酯，再將葉酸活性酯與殼聚糖上的氨基反應(yīng)，制得葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒。采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和核磁圖

3、譜(1H-NMR)分析葉酸與殼聚糖是否偶聯(lián)成功。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定葉酸殼聚糖偶聯(lián)物(CS(Ⅰ)-FA/CS(Ⅱ)-FA)的臨界膠束濃度(CMC)。最后進(jìn)行葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒的載藥，以TA為模型藥物，以葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒(CS(Ⅰ)-FA/CS(Ⅱ)-FA)為載體材料，采用自乳化溶劑揮發(fā)法和膜水化法制備TA-(CS(Ⅰ)-FA/CS(Ⅱ)-FA)載藥納米粒，利用高效液相法(HPLC)檢測(cè)技術(shù)對(duì)制劑進(jìn)行體外釋藥行為的研究。
　

4、　結(jié)果:Y-79細(xì)胞中FR-α的mRNA表達(dá)水平是ARPE-19的4倍，說(shuō)明癌細(xì)胞中細(xì)胞因子的基因高表達(dá);Western blot結(jié)果表明FR-α/α-Tublin條帶灰度均值及標(biāo)準(zhǔn)差在Y-79和ARPE-19細(xì)胞中分別為0.258±0.008和0.191±0.003，其中，F(xiàn)R-α在Y-79細(xì)胞的表達(dá)水平比ARPE-19細(xì)胞高1.35倍，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。同葉酸與殼聚糖比較，葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒的紅外圖譜特征峰發(fā)生明顯

5、變化，在1655cm-1左右和1557 cm-1左右處出現(xiàn)新峰，同時(shí)葉酸殼聚糖偶聯(lián)物的1H核磁光譜也發(fā)生明顯變化，在2.53ppm出現(xiàn)了新的特征峰，由此表明葉酸與殼聚糖接枝成功。經(jīng)熒光分光光度計(jì)F-4600測(cè)定葉酸殼聚糖偶聯(lián)物的臨界膠束濃度在0.02mg/ml～1.7mg/ml之間，所以當(dāng)濃度大于臨界膠束濃度值時(shí)，葉酸殼聚糖偶聯(lián)物將通過(guò)自組裝法形成表面親水核心疏水的納米粒;體外研究表明，含有等量的曲安奈德(TA)的樣品中，負(fù)載TA的葉酸