葉酸受體介導(dǎo)腫瘤靶向N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{米膠束的制備及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、聚合物納米膠束是一種多功能復(fù)合納米粒子,它是利用兩親性嵌段共聚物與自組裝技術(shù)制備而成,具有表面親水、內(nèi)部疏水的獨(dú)特殼-核結(jié)構(gòu)。利用聚合物納米膠束進(jìn)行疏水性藥物和影像對(duì)比劑靶向傳輸及控制釋放的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱門領(lǐng)域。
　　 殼聚糖作為一種極其豐富的天然可再生資源,具有優(yōu)越的生物相容性和生物降解性,在生物醫(yī)藥與生物材料領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景,它所擁有的一些特殊性質(zhì)使得它在藥物制劑上也有廣泛的應(yīng)用。目前殼聚糖衍生物納米膠束在包載藥物、造

2、影劑方面已有一些報(bào)道。
　　 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見病、多發(fā)病,腫瘤的靶向診斷及靶向治療是針對(duì)腫瘤特異性分子靶點(diǎn)而設(shè)計(jì)的腫瘤診治方案,具有特異性強(qiáng)、療效顯著及毒副作用小等特點(diǎn),是一種極具應(yīng)用前景的診治模式。尋找特異性的分子靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)及合成高度特異性的分子探針及藥物靶向傳輸系統(tǒng)、利用分子影像學(xué)無創(chuàng)實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果是當(dāng)前腫瘤診治的研究熱點(diǎn)。
　　 人類許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于正常組

3、織細(xì)胞。葉酸與葉酸受體的結(jié)合能力強(qiáng),能被高效介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,是一種極具應(yīng)用潛能的靶向物質(zhì)。葉酸受體不僅有望成為腫瘤影像診斷的新靶點(diǎn),還有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　 目的：
　　 1.共價(jià)連接法制備葉酸修飾的PLCS納米膠束(folate-N—palmitoyl chitosan,FPLCS),自組裝技術(shù)包載SPIO(FPLCS nanoparticles with SPIO loading,FPLCS-SPIO),

4、對(duì)以上產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)、粒徑、電位、外觀特點(diǎn)表征。
　　 2.通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步研究FPLCS—SPIO的細(xì)胞毒性和體外靶向性。
　　 3.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察FPLCS.SPIO在體靶向成像效果、體內(nèi)分布、動(dòng)物毒性。
　　 方法：
　　 1.負(fù)載SPIO前后FPLCS納米膠束的制備及表征:
　　 首先利用殼聚糖和N-軟脂酰合成N-軟脂酰基殼聚糖(N-palmitoyl chitosan,PLCS),將葉酸

5、高效接枝在PLCS表面,紅外光譜儀、核磁共振儀分別測(cè)定殼聚糖、PLCS、FPLCS、葉酸結(jié)構(gòu),然后利用自組裝技術(shù)將SPIO負(fù)載于聚合物膠束的疏水性內(nèi)核。
　　 FPLCS、PLCS膠束負(fù)載SPIO前后的表征包括:利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)和透射電鏡(TEM)測(cè)量膠束粒徑大小及分布、表面電荷、形態(tài),利用原子吸收法測(cè)量SPIO的負(fù)載率,測(cè)量FPLCS—SPIO、PLCS—SPIO(PLCS nanoparticleswith SPI

6、O loading,PLCS-SPIO)載藥膠束的磁學(xué)性質(zhì)觀察其是否具有超順磁性,以MRI多回波SE序列測(cè)量T2弛豫時(shí)間,計(jì)算T2弛豫率等。
　　 2.將FPLCS-SPIO膠束、FPLCS膠束、PLCS-SPIO膠束分別與L-O2肝細(xì)胞共孵育24小時(shí),利用四唑鹽比色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)考察空白載體材料的細(xì)胞毒性,評(píng)價(jià)其安全性。
　　 將FPLCS-SPIO、PLCS-S

7、PIO、SPIO分別與葉酸受體表達(dá)陽性的人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞及葉酸受體表達(dá)陰性的人非細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞共孵育8小時(shí),普魯士藍(lán)染色觀察FPLCS-SPIO體外靶向效能；Dil標(biāo)記的FPLCS—SPIO與HeLa細(xì)胞和A549細(xì)胞共孵育8小時(shí),共聚焦顯微鏡掃描進(jìn)一步觀察FPLCS-SPIO體外靶向效能及細(xì)胞內(nèi)分布。
　　 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　 建立裸小鼠荷人宮頸癌及人非小細(xì)胞肺癌皮下移植瘤動(dòng)物模型,將36只裸小

8、鼠隨機(jī)分成6組,每組6只,3組荷人宮頸癌皮下移植瘤,3組荷人非小細(xì)胞肺癌皮下移植瘤,約2-4周當(dāng)腫瘤直徑達(dá)0.8 cm以上時(shí),對(duì)裸小鼠進(jìn)行MRI掃描,按分組要求,實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈注射FPLCS-SPIO,對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射PLCS—SPIO或SPIO,注射劑量均為2 mg Fe/kg。注射前及注射后不同時(shí)間點(diǎn)(1h、4h、8h)分別進(jìn)行MRI成像,測(cè)量感興趣區(qū)(腫瘤、肌肉組織)T2WI信號(hào)強(qiáng)度,計(jì)算信號(hào)變化率,最后用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟

9、件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析。
　　 病理組織學(xué)檢查:包括常規(guī)HE染色和普魯士藍(lán)染色。
　　 DiI標(biāo)記的FPLCS-SPIO分別經(jīng)尾靜脈注入裸小鼠荷人宮頸癌及人非小細(xì)胞肺痛皮下移植瘤動(dòng)物模型,8小時(shí)后處死動(dòng)物,取組織冰凍切片熒光顯微鏡觀察FPLCS—SPIO組織分布。
　　 FPLCS—SPIO注入昆明鼠體內(nèi),對(duì)FPLCS—SPIO的在體安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功制備負(fù)載SPIO的葉

10、酸靶向N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{米膠束和非葉酸靶向N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{米膠束并對(duì)其進(jìn)行表征,DLS和TEM顯示所制備的膠束符合納米尺寸、均勻性好。Zeta電位測(cè)定示膠束表面呈正電荷,原子吸收法顯示SPIO負(fù)載效率高,磁學(xué)曲線、弛豫率測(cè)定結(jié)果顯示膠束具有超順磁性。
　　 2.細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示葉酸靶向N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{米膠束包載SPIO后明顯減低SPIO的毒性,膠束本身幾乎無細(xì)胞毒性。普魯士藍(lán)染色顯示FPLCS-SPIO與HeLa細(xì)胞共

11、孵育后,細(xì)胞內(nèi)大量鐵存在；PLCS-SPIO、SPIO與HeLa細(xì)胞共孵育后細(xì)胞內(nèi)只有極少量鐵呈點(diǎn)狀存在,FPLCS-SPIO、PLCS-SPIO、SPIO與A549細(xì)胞共孵育后細(xì)胞內(nèi)也只有極少量鐵存在。
　　 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　 成功建立荷人宮頸癌及人非小細(xì)胞肺癌裸小鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型。在體MRI成像結(jié)果顯示,注射FPLCS—SPIO后人宮頸癌腫瘤部位不同時(shí)點(diǎn)的T2WI強(qiáng)度及信號(hào)變化率均有明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

12、F=38.76,P=0.000)。而非靶向組在注射后1h、4h、和8h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)亦有輕度下降,但信號(hào)下降幅度較葉酸靶向組低,且持續(xù)時(shí)間短。
　　 病理學(xué)檢查:HE染色證實(shí)所建立的裸小鼠動(dòng)物模型符合人宮頸癌及人非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)特征。普魯士藍(lán)染色顯示注入FPLCS-SPIO后人宮頸癌腫瘤組織內(nèi)有較多藍(lán)染的鐵顆粒,而非靶向組則幾乎未見鐵顆粒的存在。
　　 熒光顯微鏡觀察顯示DiI標(biāo)記的FPLCS-SPIO主要分布于人宮

13、頸癌腫瘤組織中,腎、肝、脾、人非小細(xì)胞肺癌腫瘤可見中等量的分布,肺、卵巢、小腸和腦組織中只有極少量熒光分布。
　　 在體的初步安全性評(píng)價(jià)提示負(fù)載SPIO的FPLCS對(duì)裸小鼠無明顯急性毒副作用,安全性較高。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過共價(jià)連接法可成功將葉酸分子接枝在PLCS上,所得FPLCS為水脂兩親性材料,在水溶液中可自組裝成納米膠束并可成功包載疏水性SPIO。
　　 2.FPLCS-SPIO對(duì)于表達(dá)葉