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文檔簡介
1、聚合物納米膠束是一種多功能復合納米粒子,它是利用兩親性嵌段共聚物與自組裝技術制備而成,具有表面親水、內部疏水的獨特殼-核結構。利用聚合物納米膠束進行疏水性藥物和影像對比劑靶向傳輸及控制釋放的研究已經(jīng)成為一個熱門領域。
殼聚糖作為一種極其豐富的天然可再生資源,具有優(yōu)越的生物相容性和生物降解性,在生物醫(yī)藥與生物材料領域有廣闊應用前景,它所擁有的一些特殊性質使得它在藥物制劑上也有廣泛的應用。目前殼聚糖衍生物納米膠束在包載藥物、造
2、影劑方面已有一些報道。
腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的常見病、多發(fā)病,腫瘤的靶向診斷及靶向治療是針對腫瘤特異性分子靶點而設計的腫瘤診治方案,具有特異性強、療效顯著及毒副作用小等特點,是一種極具應用前景的診治模式。尋找特異性的分子靶點、設計及合成高度特異性的分子探針及藥物靶向傳輸系統(tǒng)、利用分子影像學無創(chuàng)實時的監(jiān)測腫瘤治療效果是當前腫瘤診治的研究熱點。
人類許多上皮來源的腫瘤細胞表面葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于正常組
3、織細胞。葉酸與葉酸受體的結合能力強,能被高效介導進入腫瘤細胞,是一種極具應用潛能的靶向物質。葉酸受體不僅有望成為腫瘤影像診斷的新靶點,還有望成為腫瘤治療的新靶點。
目的:
1.共價連接法制備葉酸修飾的PLCS納米膠束(folate-N—palmitoyl chitosan,FPLCS),自組裝技術包載SPIO(FPLCS nanoparticles with SPIO loading,FPLCS-SPIO),
4、對以上產物進行結構、粒徑、電位、外觀特點表征。
2.通過細胞實驗初步研究FPLCS—SPIO的細胞毒性和體外靶向性。
3.通過動物實驗考察FPLCS.SPIO在體靶向成像效果、體內分布、動物毒性。
方法:
1.負載SPIO前后FPLCS納米膠束的制備及表征:
首先利用殼聚糖和N-軟脂酰合成N-軟脂?;鶜ぞ厶?N-palmitoyl chitosan,PLCS),將葉酸
5、高效接枝在PLCS表面,紅外光譜儀、核磁共振儀分別測定殼聚糖、PLCS、FPLCS、葉酸結構,然后利用自組裝技術將SPIO負載于聚合物膠束的疏水性內核。
FPLCS、PLCS膠束負載SPIO前后的表征包括:利用動態(tài)光散射儀(DLS)和透射電鏡(TEM)測量膠束粒徑大小及分布、表面電荷、形態(tài),利用原子吸收法測量SPIO的負載率,測量FPLCS—SPIO、PLCS—SPIO(PLCS nanoparticleswith SPI
6、O loading,PLCS-SPIO)載藥膠束的磁學性質觀察其是否具有超順磁性,以MRI多回波SE序列測量T2弛豫時間,計算T2弛豫率等。
2.將FPLCS-SPIO膠束、FPLCS膠束、PLCS-SPIO膠束分別與L-O2肝細胞共孵育24小時,利用四唑鹽比色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)考察空白載體材料的細胞毒性,評價其安全性。
將FPLCS-SPIO、PLCS-S
7、PIO、SPIO分別與葉酸受體表達陽性的人宮頸癌細胞株HeLa細胞及葉酸受體表達陰性的人非細胞肺癌細胞株A549細胞共孵育8小時,普魯士藍染色觀察FPLCS-SPIO體外靶向效能;Dil標記的FPLCS—SPIO與HeLa細胞和A549細胞共孵育8小時,共聚焦顯微鏡掃描進一步觀察FPLCS-SPIO體外靶向效能及細胞內分布。
3.動物實驗:
建立裸小鼠荷人宮頸癌及人非小細胞肺癌皮下移植瘤動物模型,將36只裸小
8、鼠隨機分成6組,每組6只,3組荷人宮頸癌皮下移植瘤,3組荷人非小細胞肺癌皮下移植瘤,約2-4周當腫瘤直徑達0.8 cm以上時,對裸小鼠進行MRI掃描,按分組要求,實驗組經(jīng)尾靜脈注射FPLCS-SPIO,對照組經(jīng)尾靜脈注射PLCS—SPIO或SPIO,注射劑量均為2 mg Fe/kg。注射前及注射后不同時間點(1h、4h、8h)分別進行MRI成像,測量感興趣區(qū)(腫瘤、肌肉組織)T2WI信號強度,計算信號變化率,最后用SPSS12.0統(tǒng)計軟
9、件進行統(tǒng)計、分析。
病理組織學檢查:包括常規(guī)HE染色和普魯士藍染色。
DiI標記的FPLCS-SPIO分別經(jīng)尾靜脈注入裸小鼠荷人宮頸癌及人非小細胞肺痛皮下移植瘤動物模型,8小時后處死動物,取組織冰凍切片熒光顯微鏡觀察FPLCS—SPIO組織分布。
FPLCS—SPIO注入昆明鼠體內,對FPLCS—SPIO的在體安全性進行初步評價。
結果:
1.成功制備負載SPIO的葉
10、酸靶向N-軟脂?;鶜ぞ厶羌{米膠束和非葉酸靶向N-軟脂酰基殼聚糖納米膠束并對其進行表征,DLS和TEM顯示所制備的膠束符合納米尺寸、均勻性好。Zeta電位測定示膠束表面呈正電荷,原子吸收法顯示SPIO負載效率高,磁學曲線、弛豫率測定結果顯示膠束具有超順磁性。
2.細胞毒性試驗顯示葉酸靶向N-軟脂酰基殼聚糖納米膠束包載SPIO后明顯減低SPIO的毒性,膠束本身幾乎無細胞毒性。普魯士藍染色顯示FPLCS-SPIO與HeLa細胞共
11、孵育后,細胞內大量鐵存在;PLCS-SPIO、SPIO與HeLa細胞共孵育后細胞內只有極少量鐵呈點狀存在,FPLCS-SPIO、PLCS-SPIO、SPIO與A549細胞共孵育后細胞內也只有極少量鐵存在。
3.動物實驗:
成功建立荷人宮頸癌及人非小細胞肺癌裸小鼠皮下移植瘤動物模型。在體MRI成像結果顯示,注射FPLCS—SPIO后人宮頸癌腫瘤部位不同時點的T2WI強度及信號變化率均有明顯下降,具有統(tǒng)計學差異(
12、F=38.76,P=0.000)。而非靶向組在注射后1h、4h、和8h三個時間點的信號亦有輕度下降,但信號下降幅度較葉酸靶向組低,且持續(xù)時間短。
病理學檢查:HE染色證實所建立的裸小鼠動物模型符合人宮頸癌及人非小細胞肺癌組織學特征。普魯士藍染色顯示注入FPLCS-SPIO后人宮頸癌腫瘤組織內有較多藍染的鐵顆粒,而非靶向組則幾乎未見鐵顆粒的存在。
熒光顯微鏡觀察顯示DiI標記的FPLCS-SPIO主要分布于人宮
13、頸癌腫瘤組織中,腎、肝、脾、人非小細胞肺癌腫瘤可見中等量的分布,肺、卵巢、小腸和腦組織中只有極少量熒光分布。
在體的初步安全性評價提示負載SPIO的FPLCS對裸小鼠無明顯急性毒副作用,安全性較高。
結論:
1.通過共價連接法可成功將葉酸分子接枝在PLCS上,所得FPLCS為水脂兩親性材料,在水溶液中可自組裝成納米膠束并可成功包載疏水性SPIO。
2.FPLCS-SPIO對于表達葉
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