CD147單抗介導的α-常春藤皂苷殼聚糖納米粒的制備及其肝腫瘤靶向性研究.pdf

1、目的:以殼聚糖(Chitosan,CS)為載體,以水難溶性藥物α-常春藤皂苷(α-Hederin,α-Hed)為模型藥物,制備α-常春藤皂苷殼聚糖納米粒(α-Hed-CS-NP,αHCS),再以肝腫瘤細胞表面高度表達的CD147單抗為靶頭,將其偶聯(lián)修飾于納米粒表面制備CD147介導的α-常春藤皂苷殼聚糖納米粒(α-Hed-CS-CD147-NP,αHCD),從而通過納米粒的緩釋效果和單抗介導的主動靶向性達到減毒增效的作用。
　　方

2、法:(1)以平均粒徑、多分散指數(shù)(Polydisperse Index,P.I.)和包封率(Entrapment Efficiency,EE)為綜合指標,采用乳化-溶劑擴散法制備αHCS,并采用單因素試驗和正交試驗設計,考察納米粒處方和制備工藝。紅外(FT-IR)、X射線衍射(XRD)、差示掃描量熱分析(DSC)等對αHCS納米粒進行表征,同時系統(tǒng)考察納米粒的體外釋放行為及其相關藥劑學性質(zhì)。(2)采用EDC/NHS酰胺化反應制備αHCD

3、,并對納米粒進行粒徑測定、FT-IR和XRD表征;采用BCA試劑盒和ELISA法分別建立CD147單抗的含量和活性測定方法;依據(jù)HepG2細胞對不同單抗修飾量納米粒的攝取結果,選擇合適的單抗修飾量。(3)以未載藥的CD147單抗介導的殼聚糖納米粒(Void CS-CD147-NP,VCD)為對照,MTT法考察CD147單抗對肝腫瘤細胞活性的抑制作用、α-Hed及其納米粒對HepG2、SMMC-7721、HSC的細胞毒作用;采用流式細胞術

4、檢測原料藥及其納米粒對HepG2細胞的凋亡效果和對其細胞周期的影響。(4)流式細胞術方式考察HepG2在2h和24h內(nèi)αHCS和αHCD的攝取率,HSC細胞作為對照細胞考察兩種納米粒的攝取差異性,并通過加入過飽和CD147進行納米粒的競爭性抑制試驗;多種細胞內(nèi)吞抑制劑對兩種納米粒的攝取機制進行探討,并考察兩種納米粒在體內(nèi)的攝取分布過程。(5)分別以生理鹽水組為陰性對照,環(huán)磷酰胺為陽性對照,HepG2細胞裸鼠腫瘤模型腹腔注射給予α-Hed

5、及其納米粒后,考察其體內(nèi)藥效學;采用小動物活體成像技術,動態(tài)考察納米粒在荷HepG2細胞裸鼠體內(nèi)的組織分布及其腫瘤靶向性。
　　結果:(1)乳化溶劑擴散法制備的αHCS納米粒粒徑分布均勻,平均粒徑(92.7±2.77)nm,P.I.(0.134±0.036),包封率(75.63±4.06)％;透射電鏡觀察納米粒外觀形態(tài)圓整;FT-IR、XRD、DSC表征結果表明藥物已分散于殼聚糖納米粒中;體外釋放顯示殼聚糖納米粒具有一定的緩釋特性

6、。(2)CD147能通過酰胺反應偶聯(lián)修飾到αHCS表面;與αHCS的粒徑相比,αHCD的粒徑變化較小;偶聯(lián)所得αHCS中CD147單抗飽和修飾量為(6.55±0.234)μg/mgNP,結合不同修飾量對納米粒攝取結果影響、單抗的活性和過多修飾量可能產(chǎn)生的空間位阻效應等因素,本實驗最終確定修飾量為1.5μg/mgNP,且單抗活性保留率為(57.07±0.60)％。(3)MTT實驗結果表明未載藥單抗修飾的殼聚糖納米粒VCD及本實驗所用CD1

7、47單抗修飾量均對肝腫瘤細胞無細胞毒作用,原料藥及其納米粒對HepG2、SMMC-7721的IC50值為αHCD<αHCS<α-Hed,以HSC細胞為對照,提示與單抗介導的主動靶向性有關;通過細胞凋亡實驗結果與HepG2細胞MTT實驗相一致;在細胞周期實驗中發(fā)現(xiàn)細胞在S期的百分比有所增加。(4)HepG2細胞對納米粒攝取具有時間依賴性,且αHCD的攝取明顯高于αHCS,另外HSC對兩種納米粒攝取無差異,結合過飽和競爭抑制實驗中αHCD攝

8、取率明顯下降,說明αHCD納米粒對肝腫瘤細胞具有更好的親和性;從攝取抑制劑實驗結果可發(fā)現(xiàn)載藥納米粒的內(nèi)吞攝取過程屬于能量依賴型,需通過形成有被小窩內(nèi)陷和網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞進入細胞,且與細胞膜結構穩(wěn)定性和流動性息息相關。倒置熒光顯微鏡結果顯示納米粒1h時大多聚集在細胞膜表面,3h時細胞攝入納米粒明顯增多。(5)體內(nèi)藥效學實驗中,αHCS(79.02％)和αHCD(88.43％)納米粒的抑瘤率遠高于原料藥中劑量組(53.83％);納米粒組抑

9、瘤率均在70％以上,且存在劑量依賴性。近紅外熒光成像實驗結果發(fā)現(xiàn),尾靜脈給藥1h后,兩種納米粒在腫瘤部位和肝臟可見較為集中的熒光分布,在6h時,腫瘤部位熒光強度有所減弱,12h后納米粒熒光開始減弱。
　　結論:乳化溶劑擴散法制備的αHCS大小分布均勻、外觀形態(tài)圓整、包封率高,有緩釋特性,體外體內(nèi)藥效學實驗表明空白納米粒與細胞具有生物相容性,αHCD對肝腫瘤細胞的毒副作用的增強和肝腫瘤細胞對該納米粒攝取的增多與CD147單抗介導的主