鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒的制備及其抗腫瘤活性的檢測(cè).pdf

1、背景:
　　 惡性腫瘤在發(fā)達(dá)國(guó)家是引起死亡的主要因?yàn)?在發(fā)展中國(guó)家為引起死亡的第二大因?yàn)?。在發(fā)展中國(guó)家由于人口的日益增長(zhǎng)、人口老齡化及吸煙、運(yùn)動(dòng)量減少、飲食西方化等與癌癥相關(guān)的生活方式的日益普遍,導(dǎo)致腫瘤發(fā)病率不斷增長(zhǎng)。2011年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)GLOBOCAN發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)告表明,2008年新發(fā)癌癥病例達(dá)1270萬(wàn),因癌癥而死亡的人數(shù)達(dá)到760萬(wàn),全世界癌癥死亡人數(shù)預(yù)計(jì)將繼續(xù)上升,到2030年將超過(guò)1100萬(wàn)。在惡性腫瘤治療

2、中,化學(xué)治療是當(dāng)今臨床治療腫瘤的重要手段之一,它可以降低術(shù)前的腫瘤負(fù)荷、及早控制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶、降低腫瘤分期,使手術(shù)切除成為可能,降低術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,延長(zhǎng)晚期腫瘤患者的生存期和提高患者的生活質(zhì)量,在腫瘤治療中發(fā)揮著不可替代的作用。但傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物通過(guò)體內(nèi)給藥,經(jīng)過(guò)分布、代謝、排泄等過(guò)程后,只有少量的藥物到達(dá)靶器官、靶組織和靶細(xì)胞。因此,提高腫瘤部位藥物的濃度就必須增加給藥劑量,相應(yīng)也增大了藥物的毒副作用。同時(shí)化療藥物對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤

3、細(xì)胞缺乏選擇性,在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。從而引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)及化療反應(yīng)率低,限制了其臨床應(yīng)用。因此,越來(lái)越多的研究工作者利用納米粒在腫瘤部位的增強(qiáng)滲透和滯留(enhanced pemeability and retention,EPR)效應(yīng),以納米粒為載體提高化療藥物的抗腫瘤作用。
　　 納米粒子也叫超微顆粒,是處在原子簇和宏觀物體交界的過(guò)渡區(qū)域,從通常的關(guān)于微觀和宏觀的觀點(diǎn)看,這樣的系統(tǒng)既非典型的

4、微觀系統(tǒng)亦非典型的宏觀系統(tǒng),是一種典型的介觀系統(tǒng),它具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng),因而顯示出若干奇異的特性,諸如低熔點(diǎn)、高比熱容、高膨脹系數(shù)、高反應(yīng)活性、高擴(kuò)散率、高強(qiáng)度、高韌性、表面反應(yīng)活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等。納米技術(shù)在對(duì)疾病的影像學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷、生物傳感器診斷以及生物芯片診斷等方面迅速發(fā)展,使患者得到更為及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷。在治療方面,利用納米粒子作為新的藥物傳遞和控釋的載體,是由于其比血紅

5、細(xì)胞還小許多,可在血液中自由運(yùn)行,具有穿過(guò)靶組織內(nèi)皮細(xì)胞的能力,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),將所包含的藥物在細(xì)胞和/或亞細(xì)胞水平釋放,大大提高藥物療效。還可提高難溶性藥物的溶解性,增加藥物與胃腸道液體有效接觸面積,有利于提高藥物利用率,提高療效。此外,納米?？梢园饪s、保護(hù)核苷酸,使其免遭核酸酶的降解,可以作為基因轉(zhuǎn)移載體,將DNA和RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面,或在納米粒表面耦聯(lián)特異性的靶向分子,如特異性配體、單克隆抗體等

6、,通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療。因而納米載藥體系在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,特別是在腫瘤的治療方面得到了廣泛的研究及應(yīng)用。
　　 殼聚糖(Chitosan,CS),是一種廣泛存在于自然界的聚陽(yáng)離子多糖衍生物。又稱可溶性甲殼質(zhì)、甲殼胺、幾丁聚糖等,是N-乙酰-D-葡糖胺和D-糖胺的共聚物,由甲殼素堿化脫乙?；?其結(jié)構(gòu)類似于纖維素。殼聚糖含有游離氨基,呈弱堿性,不溶于水和有機(jī)溶劑,但溶于酸性溶

7、液。殼聚糖在酸性溶液中其氨基基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化,帶有大量正電荷,可與帶負(fù)電荷的聚合物、大分子甚至一些聚陰離子相互作用,由此發(fā)生的溶膠.凝膠轉(zhuǎn)變過(guò)程則可方便地用于載藥納米粒的制備。在藥物載體研究中,殼聚糖因其具有良好的組織相容性、生物可降解性及無(wú)毒性而備受關(guān)注。由殼聚糖形成的載藥納米粒不僅提高了疏水性藥物的溶解度、控制藥物釋放、延長(zhǎng)藥物療效、降低藥物毒副作用,還可以大大加強(qiáng)制劑的腫瘤靶向給藥能力。因此,利用殼聚糖納米粒作為高血壓藥物、化療藥物

8、、胰島素、疫苗、抗生素等藥物的緩釋、控釋載體得到了廣泛研究。
　　 鹽酸洛拉曲克(nolatrexed dihydrochloride,NLTX)是非經(jīng)典型結(jié)構(gòu)葉酸類胸苷酸合成酶(TS)抑制劑,通過(guò)干擾DNA合成阻止細(xì)胞分裂增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對(duì)頭頸癌、結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌等多種實(shí)體瘤有較好臨床療效。但其在細(xì)胞內(nèi)的半衰期短(僅173分鐘),需持續(xù)靜脈給藥維持穩(wěn)定血藥濃度,但同時(shí)引起正常組織的不良反應(yīng),包括皮疹

9、、黏膜炎、中性粒細(xì)胞減少和血小板減少等,這種劑量限制性毒性影響其臨床應(yīng)用。
　　 本研究我們選用殼聚糖(CS)作為原材料,采用陰離子凝聚法制備出包裹有鹽酸洛拉曲克的載藥納米粒,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,制備較為理想的殼聚糖納米粒,考察其理化特性,通過(guò)體外細(xì)胞毒試驗(yàn)和體內(nèi)抑瘤試驗(yàn),探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,制備較為理想的殼聚糖納米粒(CS NPs),并負(fù)

10、載鹽酸洛拉曲克(NLTX),檢測(cè)其表征。
　　 2.研究不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒的體外釋藥性能、載藥量及包封率的影響。
　　 3.觀察鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒在體外對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用,證明殼聚糖載藥納米粒與游離藥物同樣具有抗腫瘤效應(yīng),進(jìn)一步證明殼聚糖納米粒能夠給對(duì)藥物起到緩釋作用,可以彌補(bǔ)鹽酸洛拉曲克半衰期較短的缺點(diǎn)。
　　 4.對(duì)移植瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)抑瘤試驗(yàn),證明鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒較游

11、離洛拉曲克具有更好的體內(nèi)抑瘤作用,可以成為鹽酸洛拉曲克的理想藥物載體。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用殼聚糖上帶正電的氨基與TPP的陰離子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成殼聚糖納米粒(CS NPs),反應(yīng)過(guò)程中同時(shí)將鹽酸洛拉曲克(NLTX)包裹其中而制成載藥納米粒(NLTX-CS NPs),透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)特征,激光粒度分析儀測(cè)定粒徑大小及分布,紫外分光光度法測(cè)定納米粒的載藥量及包封率,在磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中運(yùn)用動(dòng)

12、態(tài)透析法考察載藥納米粒的體外釋放特性。
　　 2.體外培養(yǎng)CNE-1鼻咽癌細(xì)胞,通過(guò)MTT法測(cè)定和研究不同濃度的載藥納米粒、空白納米粒和游離藥物與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24h、48h、72h后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率,并推算當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50％時(shí)的所需藥物濃度,即IC50值。
　　 3.制備4T1乳腺癌移植瘤小鼠,隨機(jī)分為載藥納米粒、游離藥物和生理鹽水三組,采用尾靜脈注射方法給藥,給藥后每三天測(cè)量小鼠腫瘤長(zhǎng)徑及短徑,第15天處死小

13、鼠,剝離瘤體,計(jì)算腫瘤體積(V=Dmax×Dmin2/2),并計(jì)算各組抑瘤率。
　　 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,鹽酸洛拉曲克的濃度與吸光度之間的關(guān)系采用曲線擬合分析；體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析,組間比較采用單向方差分析(one-way ANOVA)；體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)的組間比較采用單向方差分析,經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)后,組間多重比較采用采用LSD法或Du

14、nnett's法；游離藥物組與載藥納米粒組抑瘤率的比較采用Independent Samples t test,以P<0.05表示差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.制備鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒的最佳條件為:殼聚糖溶液pH為5.1,CTS/TPP質(zhì)量比為6:1,CTS/NLTX質(zhì)量比為6:1。制備的載藥納米粒呈類圓形,分散性良好,平均粒徑232nm,多分散系數(shù)(PDI)為0.37,Zeta電位24.4mv,載藥率為

15、(19.38±0.52)％,包封率為(63.93±0.74)％,7d內(nèi)累積釋藥量達(dá)到(68.38±3.90)％。
　　 2.載藥殼聚糖納米粒在體外對(duì)CNE-1鼻咽癌細(xì)胞株的增殖抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性,隨藥物濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制率逐漸提高；藥物作用72h,游離藥物組與載藥納米粒組的IC50值無(wú)顯著性差異(P=0.506)。而空白納米粒僅在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用。
　　 3.第15天生理鹽水對(duì)照

16、組的腫瘤體積顯著高于載藥納米粒組、游離藥物組(P=0.000)；載藥納米粒組的抑瘤率為41.63％,與游離藥物組比較,顯著提高了藥物的抗腫瘤作用(P=0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.采用陰離子凝聚法制備的鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒制備工藝簡(jiǎn)單,形狀規(guī)則、粒度分布均勻、具有較高包封率和較好緩釋性能。
　　 2.鹽酸洛拉曲克殼聚糖納米粒在體內(nèi)外均顯示了長(zhǎng)效抗腫瘤作用,殼聚糖納米粒劑型有望成為鹽酸洛拉曲克的理想載