蟲草素羧甲基殼聚糖納米粒的制備、釋藥性能及體外抗腫瘤作用研究.pdf

1、背景：
　　蟲草素(cordecepin，Cor)是1950年加拿大科學家Cunningham等在Cordyceps militaris Link原漿液中分離得到的一種核苷類抗菌素。研究證明蟲草素不僅具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗白血病等作用，還具有抗菌、抗病毒、消炎、降血糖、降血脂、抗衰老等多種生理活性和重要的藥用價值，具有良好的臨床應用前景。但是蟲草素在體內(nèi)腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）的代謝下快速脫氨

2、基成為無生物活性的代謝產(chǎn)物3'-脫氧次黃嘌呤核苷，限制了其單獨用于臨床，而與ADA抑制劑聯(lián)合應用易出現(xiàn)嚴重的不良反應。
　　目的：
　　為了解決蟲草素在體內(nèi)被ADA快速降解的問題，本論文選用羧甲基殼聚糖(carboxy-methyl chitosan，CMC)作為藥物載體，制備蟲草素羧甲基殼聚糖納米粒(Cordycepin loadedcarboxymethyl chitosan nanoparticles，Cor-CMC-

3、Nps)，研究其在體內(nèi)、外釋放蟲草素的規(guī)律，觀察對人肝癌HepG-2細胞生長的抑制作用，以探討這一新型載藥系統(tǒng)是否能延緩蟲草素的代謝、延長其作用時間。
　　1.蟲草素羧甲基殼聚糖納米粒的制備
　　方法：
　　1.以液體石蠟/司盤-80為油相，CMC為水相，三聚磷酸鈉(TPP)為交聯(lián)劑，采用乳化離子交聯(lián)法制備Cor-CMC-Nps。通過單因素考察和正交設(shè)計試驗對制備工藝和處方進行優(yōu)化。
　　2.應用超速離心-UV法

4、測定Cor-CMC-Nps的包封率和載藥量。納米粒度及電位分析儀測定納米粒的粒徑與表面電位;透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米粒表面形態(tài);差示掃描量熱儀(DSC)和X射線衍射儀(XRD)分析納米粒中蟲草素的物理狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1.單因素考察結(jié)果表明:超聲功率、司盤-80用量和CMC濃度對Cor-CMC-Nps的粒徑和包封率有較大影響，Cor投藥量影響較小，TPP濃度基本沒有影響。
　　2.正交試驗結(jié)果表明:司盤-

5、80用量和CMC濃度對包封率有顯著影響，前者影響力大于后者，超聲功率影響不明顯。最佳處方和制備工藝為:司盤-80:2mg，CMC:6 mg/ml，超聲功率:200W。
　　3.研制的Cor-CMC-Nps在透射電鏡下呈球形或類球形，表面圓整，平均粒徑為147.6nm，Zeta電位為-24.1 mV，包封率為69.6％，載藥量為9.02％，DSC和XRD顯示藥物是以無定形狀態(tài)存在。
　　2.蟲草素羧甲基殼聚糖納米粒體內(nèi)外釋放研

6、究
　　方法：
　　1.體外釋放:采用動態(tài)透析法研究Cor-CMC-Nps在三種不同釋放介質(zhì)中的釋放情況。(1)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4);(2) PBS+血清;(3) PBS+ADA(8.8U/L)。用UV法測定介質(zhì)中Cor濃度，計算累積釋放率，分別按零級釋放、一級釋放、Higuchi方程以及Weibull分布模型對體外釋放曲線進行擬合。
　　2.體內(nèi)釋放:給ICR小鼠分別腹腔注射(ip) Cor溶液和Cor

7、-CMC-Nps，劑量均為100mg/kg（以Cor計算），分別于給藥后不同時間取血，HPLC-PDA法測定Cor血藥濃度，計算藥時曲線下面積(AUC)，考察Cor-CMC-Nps的體內(nèi)釋放情況。HPLC色譜條件:色譜柱:ZOXBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）;檢測器:PDA;流動相:水-甲醇=88∶12;流速:1ml/min;檢測波長λ:260nm;柱溫:30℃;進樣量:20μl。
　　結(jié)果：
　　1

8、.在PBS中的釋放:Cor溶液:2h、6h、24h累積釋放率分別為80.8％、90.0％、93.7％。Cor-CMC-Nps:2h、6h、24h、48h累積釋放率分別為27.2％、38.2％、57.1％、68.1％。
　　2.在PBS+血清中的釋放:Cor溶液:2h、10h累積釋放率分別為62.2％、69.9％，之后未檢測出。Cor-CMC-Nps:2h、10h、24h、48h累積釋放率分別為35.3％、62.0％、70.9％、8

9、0.4％。
　　3.在PBS+ADA中的釋放:2h、8h累積釋放率分別為17.5％、20.1％，之后未檢測出。Cor-CMC-Nps:2h、8h、24h、48h累積釋放率分別為19.2％、25.8％、31.8％、35.5％。結(jié)果表明，在緩沖液、血清及降解酶的存在下，Cor-CMC-Nps均表現(xiàn)出良好的緩釋作用。
　　4.體外釋放規(guī)律:Cor-CMC-Nps在三種介質(zhì)中的釋放曲線用Weibull分布函數(shù)模型擬合，獲得了最佳的擬

10、合結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.9792～0.9945。
　　5.體內(nèi)釋放:小鼠ip Cor溶液，0.5h血藥濃度達高峰（8.85±0.43μg/ml），1h內(nèi)濃度很快下降。給予Cor-CMC-Nps后，2.5h血藥濃度達高峰（10.02±0.40μg/ml），4h內(nèi)濃度下降較快，4h后下降速度非常緩慢。AUCNps/AUCCor為1.11，濃度在6μg/ml以上的(AUCNps/AUCCor)＞6μg/ml之比為1.76。表明Cor-CM

11、C-Nps在體內(nèi)具有緩釋作用，且維持高水平濃度的時間和AUC均較Cor溶液高。
　　3.蟲草素羧甲基殼聚糖納米粒對HepG-2細胞的抑制作用
　　方法：
　　1.細胞分組:(1)空白對照組:含10％新生牛血清的DMEM;(2)陽性對照組:DDP5，10，20μg/ml;(3)陰性對照組:空白羧甲基殼聚糖納米粒(CMC-Nps);(4) Cor溶液組:30,60,90,120,150μg/ml;(5) Cor-CMC-N

12、ps組:30,60,90,120,150μg/ml（為含有的Cor濃度）。
　　2.體外培養(yǎng)HepG-2細胞，分別按上述分組加藥，使終濃度達到上述濃度，培養(yǎng)24h、48h、72h后，用MTT法測定各組細胞OD值，計算細胞抑制率，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　3.體外培養(yǎng)HepG-2細胞，分組加藥同上，然后在各實驗孔分別加入0.3μl ADA(2.0×10-3U/μl)，測定在ADA存在條件下各組細胞的抑制率。
　　結(jié)果

13、：
　　1.未加ADA細胞抑制率:Cor組:上述5個濃度在24h、48h、72h對HepG-2細胞抑制率分別為21.6％～55.4％(P＜0.001),27.2％～58.5％(P＜0.001),13.8％～47.8％(P＜0.001)。同一時間下，抑制率隨藥物濃度增加而增強。Cor-CMC-Nps組:5個濃度在24h、48h、72h的抑制率分別為9.52％48.2％(P＜0.01，0.001)，31.4％～68.5％(P＜0.00

14、1)，35.9％～75.1％(P＜0.001)。抑制率隨藥物濃度增加以及作用時間延長而增強。表明Cor-CMC-Nps和Cor均可抑制HepG-2細胞的生長。
　　2.Cor-CMC-Nps和Cor對細胞抑制作用的比較:Cor-CMC-Nps各濃度(120μg/ml除外，P＜0.01)在24h抑制細胞生長作用均較Cor組弱(P＜0.001)，但48h和72h則相反，納米粒組作用均顯著強于Cor組(P＜0.001)。作用高峰時間納米

15、粒組在72h，Cor組在48h，最大抑制率納米粒組75.1％，Cor組58.5％，前者是后者的1.28倍（提高28.5％）。表明Cor-CMC-Nps作用維持時間比Cor溶液長，作用強度比Cor溶液大。
　　3.加ADA細胞抑制率:Cor組:24h、48h、72h對HepG-2細胞抑制率分別為5.46％～35.6％，4.89％～26.9％，3.34％17.8％，作用高峰前移到24h。Cor-CMC-Nps組:24h、48h、72h

16、抑制率分別為5.28％～29.1％，19.1％～43.6％，25.4％～46.0％，作用高峰仍然在72h。與Cor組相比，納米粒組的作用維持時間明顯延長。與未給ADA比較，無論是Cor組還是納米粒組，ADA的加入均減弱了抑制作用，并且Cor組作用維持時間縮短，而納米粒組作用維持時間不變。表明納米載體對蟲草素具有保護作用，可延緩其降解代謝，使作用時間延長。
　　4.細胞形態(tài):空白對照組及CMC-Nps組細胞呈梭形生長，用Cor及Co

17、r-CMC-Nps干預后，細胞形態(tài)顯著改變，梭形細胞減少或消失，細胞變圓，黏附性降低，部分漂浮于培養(yǎng)液中。球形或橢球形數(shù)量隨作用時間延長而增多，與Cor組相比，Cor-CMC-Nps組在48，72h時對HepG-2細胞的抑制作用更加明顯。
　　結(jié)論：
　　1.以液體石蠟/司盤-80為油相，羧甲基殼聚糖為水相，三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，采用乳化離子交聯(lián)法可以制備出理化性質(zhì)良好的Cor-CMC-Nps:粒徑147.6nm，Zeta電位

18、-24.1 mV，包封率69.6％，載藥量9.02％。
　　2.Cor-CMC-Nps在磷酸緩沖液及含血清和ADA的緩沖液中，均呈現(xiàn)良好的緩釋效果。
　　3.Cor-CMC-Nps在小鼠體內(nèi)具有較好的緩釋作用。
　　4.Cor-CMC-Nps和Cor均可抑制HepG-2細胞的生長，相同濃度下前者的抑制作用高于后者，作用維持時間也長于后者。
　　5.Cor-CMC-Nps可延緩Cor降解代謝，使作用時間延長，具有保