亞油酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒固定化

1、第４９集海洋科學(xué)集刊No.492008年８月STUDIAMARINASINICAAug2008亞油酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒固定化亞油酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒固定化菠蘿蛋白酶的研究菠蘿蛋白酶的研究譚玉龍，劉晨光，劉成圣，于，劉晨光，劉成圣，于樂軍樂軍（中國(guó)海洋大學(xué)（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島海洋生命學(xué)院，青島266003266003）酶的固定化技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，它可以顯著提高酶的活力和穩(wěn)定性，使酶可以在極端的pH和溫度下進(jìn)行反應(yīng)。不同的

2、劑型已應(yīng)用于酶的固定化，比如薄膜（Taniokaetal.1998Arica2000），微球（Wuetal.2005），納米粒（Akiyoshietal.1998Lietal.2003Tangetal.2007）等。最近，納米材料因?yàn)槠涮貏e的性質(zhì)與廣泛的應(yīng)用已越來越多地引起人們的關(guān)注，納米膠束和納米粒已被用于固定化酶。由聚乙二醇聚天冬氨酸嵌段共聚物制備的納米膠束可用來包埋酶分子（溶菌酶、胰蛋白酶）（Haradaetal.19982001

3、Yuanetal.2005）。Sunamoto的研究小組（Akiyoshietal.1998）曾合成了普魯蘭糖的膽甾烯基衍生物，可在水中自聚集成凝膠納米粒，并可與胰島素等藥物形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶可負(fù)載于納米粒上（Liuetal.2005），這與氯鍵疏水作用力以及離子相互作用有關(guān)。但固定化酶的性質(zhì)（比如穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)常數(shù)等）還需要進(jìn)一步研究。本文作者采用亞油酸修飾羧甲基殼聚糖，通過超聲的方法制備凝膠納米粒。選擇菠蘿

4、蛋白酶應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)——因?yàn)槠湓趧?dòng)物炎癥及人類炎性腸病等方面都有積極的治療作用。酪蛋白作為酶解反應(yīng)的底物。將菠蘿蛋白酶固定于納米粒上。探討了影響固定化酶活力的因素（包括溫度、儲(chǔ)存穩(wěn)定性等）。結(jié)果表明，酶被固定化后，熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均有提高。固定化酶的Km值小于自由酶，表明固定化可以提高酶的穩(wěn)定性并加強(qiáng)酶與底物的親和力。一、材料及方法一、材料及方法1.1.化學(xué)試劑化學(xué)試劑殼聚糖（低分子量），亞油酸（LA），1－乙基－3－（3－二甲基氨丙基

5、）碳二亞胺（EDC），菠蘿蛋白酶均購(gòu)于Sigma公司。其他試劑都采用分析純。2.2.制備方法制備方法（1）制備羧甲基殼聚糖（CMCS）Na型羧甲基殼聚糖的制備：稱取5g殼聚糖于三口燒瓶中，加入100ml水異丙醇（vv=11），攪拌，使其溶脹。加入6.75gNaOH，50℃攪拌1h。讓殼聚糖在堿性條件下膨脹形成堿化中心。將7.5g氯乙酸溶于10ml異丙醇，溶解后加到分液漏斗，向三口燒瓶中滴加，控制滴加時(shí)間30min50℃攪拌4h。反應(yīng)結(jié)束

6、后，布氏漏斗抽濾，70%、80%、90%乙醇水溶液、無水乙醇洗滌。所得產(chǎn)品放入60℃烘箱烘干即得白色粉狀羧甲基殼聚糖（Na型）。H型羧甲基殼聚糖的制備：稱取2.5gNa型羧甲基殼聚糖，加入100ml80%乙醇水溶液，攪拌。再加入10ml37%HCl溶液，攪拌30min。布氏漏斗抽濾，70%、80%、90%乙醇水溶液、本課題為山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金資助（2006ＤＳ03044）。通訊作者：劉晨光副教授傳真：8653282932

7、586。Email:liucg@ouc.。第一作者：譚玉龍碩士研究生。收稿日期：2007年１０月２５日。譚玉龍等：亞油酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒固定化菠蘿蛋白酶的研究3熱穩(wěn)定性是固定化酶的一個(gè)重要指標(biāo)，將固定化酶和自由酶保存于0.05molL的PBS緩沖OOHONH2OOCH2COOHOHONHOHOn圖1亞油酸羧甲基殼聚糖的結(jié)構(gòu)圖表1載藥量和包封率菠蘿蛋白酶(mgml)包封率(%)載藥量(%)0.050.0582.721.4782.72

8、1.4720.680.3720.680.370.10.171.571.3271.571.3235.790.6635.790.660.20.264.831.6964.831.6964.831.6964.831.690.30.362.790.7562.790.7594.191.1294.191.120.40.449.280.4949.280.4998.550.9898.550.98圖2納米粒的透射電鏡照片液(pH7.4)中，在不同溫度下保存