新型腫瘤靶向的葉酸-羧甲基殼聚糖-超順磁氧化鐵納米粒的合成及評價.pdf

1、目的：
　　 1.制備腫瘤靶向的葉酸-羧甲基殼聚糖.超順磁氧化鐵納米粒(Folic acid-o-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles(FA-OCMCS-SPIO-NPs)并對處方工藝進行優(yōu)化。
　　 2.對中間產(chǎn)物(超順磁氧化鐵納米粒和羧甲基殼聚糖超順磁氧化鐵納米粒)及終產(chǎn)物(葉酸-羧甲基殼聚糖超順磁氧化鐵納米粒)分別進行表

2、征。
　　 3.體外評價FA-OCMCS-SPIO-NPs的細胞毒性、逃避吞噬細胞吞噬作用及葉酸受體腫瘤靶向作用。
　　 4.體內(nèi)初步評價FA-OCMCS-SPIO-NPs的腫瘤靶向性及組織中分布情況。
　　 方法：
　　 1 三步法合成FA-OCMCS-SPIO-NPs
　　 即先用共沉淀法合成超順磁氧化鐵納米粒(superparamagnetic oxide ironnanopartieles

3、 SPIO-NPs),依次用羧甲基殼聚糖和葉酸對SPIO-NPs表面進行共價修飾制備FA-OCMCS-SPIO-NPs。
　　 1.1 共沉淀法合成超順磁氧化鐵納米粒
　　 考察體系的PH值、溫度、沉淀劑的種類和用量對SPIO-NPs粒徑和組成的影響。用X-Ray衍射儀、激光散射粒度分析儀、透射電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀、超導(dǎo)電子干涉等對產(chǎn)物進行表征。
　　 1.2 OCMCS對SPIO-NPs表面進行共價修飾

4、
　　 合成以SPIO-NPs為核,OCMCS為“殼”的OCMCS-SPIO-NPs。為了對合成工藝進行優(yōu)化,先單因素考察SPIO與OCMCS的比例對納米粒粒徑的影響,確定最佳的SPIO與OCMCS比例,然后,以納米粒的粒徑作為因變量,羧甲基殼聚糖的分子量(A)、濃度(B)、超聲時間(C)及超聲細胞粉碎儀的功率(D作為自變量,采用正交設(shè)計(L824)進行處方優(yōu)化和工藝篩選。用透射電鏡、激光散射粒度分析儀、電位測定儀、X-Ray衍

5、射儀、傅立葉紅外和超導(dǎo)電子干涉(superconducting quantum interference measurement device、SQUID)等對OCMCS-SPIO-NPs進行表征。MRI掃描測定弛豫率、鄰二氮菲法測定鐵含量。
　　 1.3 利用OCMCS-SPIO-NPs的氨基基團與葉酸中羧基基團發(fā)生酰胺反應(yīng)合成FA-OCMCS-SPIO-NPs,采用傅里葉紅外掃描及X-Ray粉末衍射考察不同嫁接工藝對合成的F

6、A-OCMCS-SPIO-NPs的紅外圖譜及Fe3O4晶型的影響,確定FA修飾OCMCS-SPIO-NPs的最佳工藝,按方法1.2對FA-OCMCS-SPIO-NPs進行表征；將FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和SPIO-NPs溶液4℃留樣,觀察溶液的形狀,初步考察他們的溶液穩(wěn)定性。
　　 2 共沉淀法合成葡聚糖超順磁氧化鐵納米粒(dextran-SPIO-NPs)并按方法1.2對合成的dextr

7、an-SPIO-NPs進行表征。
　　 3 體外評價細胞毒性、葉酸受體腫瘤靶向性及抗吞噬細胞吞噬作用。
　　 3.1 細胞毒性
　　 LO2細胞(正常肝細胞),葉酸受體高表達的KB細胞(人口腔上皮癌細胞)和葉酸受體不表達的A549細胞(肺小細胞腺癌細胞)常規(guī)傳代培養(yǎng)后,以5×103/孔接種于96孔板上,培養(yǎng)24h后,分別與不同濃度的FA-OCMCS-SPIO-NPs,OCMCS-SPIO-NPs、dextran-

8、SPIO-NPs和未包被的SPIO-NPs孵化24h,MTT法測定細胞毒性。
　　 3.2 腫瘤靶向性
　　 3.2.1 菲洛嗪法定量分析細胞內(nèi)鐵含量
　　 A549細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640全培溶液中、Hela細胞(人宮頸癌細胞)和KB細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于FFRPMI1640全培溶液中,以2.5×105/孔接種于24孔板,培養(yǎng)24h,PBS液洗滌三遍后,與不同濃度的FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMC

9、S-SPIO-NPs孵化24后,菲洛嗪法測定細胞內(nèi)鐵含量。
　　 3.2.2 普魯士藍染色
　　 A549細胞、Hela細胞和KB細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)后,以5×105/孔接種于6孔板上,孵化24h,分別加入0.4mgFe/ml的FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCS-SPIO-NPs2m124h后,普魯士藍染色,高倍鏡下觀察。
　　 3.3 巨噬細胞攝取實驗
　　 3.3.1 菲洛嗪法細胞內(nèi)鐵含量

10、r>　　 常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞),以2.5×105/孔接種于24孔板,培養(yǎng)24h,PBS液洗三遍后,加入一系列不同濃度的FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、dextmn-SPIO-NPs和未包被的SPIO-NPs,孵化24h后,PBS徹底清洗三遍,用0.5ml濃度為0.1M鹽酸分散,菲洛嗪法測定細胞內(nèi)鐵含量。
　　 3.3.2 普魯士藍染色
　　 常規(guī)培養(yǎng)R

11、AW264.7(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞),以5×105/孔接種于6孔板上,孵化24h后,分別加入0.4mgFe/ml的上述納米粒2ml與RAW264.7細胞孵化24h后,進行普魯士藍染色,倒置顯微鏡下觀察。
　　 4.體內(nèi)初步考察FA-OCMCS-SPIO-NPs的腫瘤靶向性及體內(nèi)分布情況
　　 4.1 體內(nèi)腫瘤靶向性考察
　　 4.1.1 實驗動物:健康,SPF級裸鼠20只、鼠齡4-6周、雌雄各半,采用隨機

12、法將其分成兩組:KB腫瘤細胞組(n=10)和A549腫瘤細胞組(n=10)。
　　 4.1.2 細胞培養(yǎng)和腫瘤模型建立
　　 A549用細胞RPMI-1640全培常規(guī)培養(yǎng)、KB細胞用FFPRMI-1640全培常規(guī)傳代培養(yǎng),0.25％胰酶-EDTA消化,PBS液洗3遍后,無血清的培養(yǎng)基稀釋制成每毫升含1.0×107/ml的細胞懸液,7號針頭注射0.2 ml于裸鼠頸背部皮下。兩周后,待瘤體最大直徑≥1.0 cm時,選取已成功

13、建立腫瘤模型的小鼠(16只,每組8只)進行動物實驗。
　　 4.1.3 MRI掃描
　　 動物分組:將上述已成功荷瘤裸鼠(16只,每組8只)進一步隨機分成四組:Ⅰ組,A549、OCMCS-SPIO-NPs(n=4)；Ⅱ組,A549、FA-OCMCS-SPIO-NPs(n=4)；Ⅲ組,KB細胞、OCMCS-SPIO-NPs(n=4)；Ⅳ組,KB細胞、FA-OCMCS-SPIO-NPs組(n=4)。
　　 4.1.3

14、.1 MRI掃描:
　　 采用西門子(Siemens Magnetom Vision Plus)1.5T,頭部線圈,冠狀面掃描,平掃后分別從尾靜脈注射OCMCS-SPIO-NPs(5.54 mg Fe/ml)或FA-OCMCS-SPIO-NPs(5.62 mg Fe/ml)混懸液,劑量為0.25ml/只,給藥3h后,MRI增強掃描。
　　 4.1.3.2 圖像分析
　　 T2WI圖像測量平掃及增強3h后四組實驗動

15、物腫瘤感興趣區(qū)(Region ofinterest,ROI)的信號強度(signal intense,SI)。測量時ROI放置在局部信號相對均勻,無明顯偽影的區(qū)域,選取同一部位,測量三次,取其平均值并計算腫瘤信號強度下降百分比(percentage of SI loss,PSIL),PSIL=|(Slenhanced-SIunenhanced)|/SIunenhanced×100％,其中SIunenhanced、SIenhanced分別

16、代表平掃、增強后感興趣區(qū)的信號強度。
　　 4.1.4 組織病理學(xué)檢查
　　 4.2 初步評價FA-OCMCS-SPIO-NPs的體內(nèi)分布
　　 5、統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS13.0軟件包,采用正交實驗的析因分析和配對t檢驗(Paired-Samples T Test)進行統(tǒng)計學(xué)處理,P<0.05統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、我們成功地合成了具有“典型核殼”結(jié)構(gòu),內(nèi)核粒徑約為10nm

17、,親水性好,強超順磁性,流體粒徑<50nm的FA-OCMCS-SPIO-NPs。
　　 2、體外細胞毒性結(jié)果表明利用羧甲基殼聚糖和葉酸對SPIO-NPs進行共價修飾能明顯降低SPl0-NPs的細胞毒性。FA-OCMCS-SPIO-NPs組對葉酸受體高表達的KB細胞明顯高于OCMCS-SPIO-NPs組,對于葉酸受體不表達的腫瘤細胞A549和LO2,FA-OCMCS-SPIO-NP和OCMCS-SPIO-NPs的細胞毒性無顯著性差

18、異。
　　 3、體外靶向性結(jié)果表明所合成的FA-OCMCS-SPIO-NP具有很強的葉酸受體靶向性,細胞表面葉酸受體表達越高,細胞內(nèi)鐵含量越高,但是OCMCS-SPIO-NPs無葉酸受體腫瘤靶向性。
　　 4、體外抗吞噬結(jié)果表明OCMCS的修飾可以明顯降低RAW264.7細胞對超順磁氧化鐵納米粒的攝取,而葉酸的進一步修飾對其吞噬作用影響很小。
　　 5、體內(nèi)實驗表明FA-OCMCS-SPIO-NPs具有高的葉酸受