dsNKG2D-IL-15殼聚糖納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性.pdf

1、DsNKG2D-IL-15為2個(gè)NKG2D分子的胞外區(qū)和IL-15的融合蛋白，基于NKG2D分子識(shí)別高表達(dá)于大部分腫瘤細(xì)胞表面的MICA等配體分子，并通過(guò)IL-15發(fā)揮激活NK和CD8+T細(xì)胞的功能，前期研究已證實(shí)，該融合蛋白具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。殼聚糖納米材料是一種新興的藥物載體，在基因疫苗以及各類(lèi)抗腫瘤藥物的運(yùn)輸過(guò)程中扮演越來(lái)越重要的角色。殼聚糖具有生物相容性高，毒性較低，且具有生物可降解性等優(yōu)勢(shì)，可作為載體來(lái)制備抗腫瘤納米顆粒。本

2、課題擬將前期構(gòu)建的pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組質(zhì)粒、以及自行制備的dsNKG2D-IL-15融合蛋白分別裝載入HTCC(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖納米顆粒中，形成一定大小的納米凝膠顆粒，體內(nèi)外分別評(píng)估其激活淋巴細(xì)胞的效應(yīng)以及抗腫瘤的效果。
　　研究?jī)?nèi)容分為2個(gè)部分:
　　1.裝載pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因的納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性
　　目的:利用化學(xué)修飾過(guò)的殼聚糖(

3、HTCC)以及前期工作中構(gòu)建好的重組基因(pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15)來(lái)制備抗腫瘤納米顆粒。檢測(cè)該納米顆粒的理化性質(zhì)，并觀察其能否將重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，且在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)NKG2D和IL-15的融合蛋白。體外觀察腫瘤細(xì)胞受該納米基因顆粒轉(zhuǎn)染后，對(duì)NK與CD8+T細(xì)胞活性的影響，并且體內(nèi)觀察該納米基因顆粒拮抗B16BL6-MICA黑色素移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。
　　方法:首先將HTCC與重組質(zhì)粒分別按照質(zhì)量比1∶2，2∶

4、1，1∶1混合，震蕩裝載后，離心取上清，用分光光度計(jì)檢測(cè)其中DNA濃度，按照（DNA總量-游離DNA）/DNA總量的公式來(lái)計(jì)算包封率。取制備好的納米顆粒，用適量的超純水或PBS緩沖液稀釋后，檢測(cè)納米顆粒的粒徑大小及其表面電荷。其次使用MTS/PMS試劑盒檢測(cè)納米顆粒對(duì)RAW264.7以及B16BL6等細(xì)胞的毒性大小。然后，將脂質(zhì)體以及單體蛋白作為對(duì)照，使用納米顆粒轉(zhuǎn)染CT-26等細(xì)胞，72h后通過(guò)FCM檢測(cè)NKG2D的表達(dá);使用檢測(cè)IL

5、-15的ELISA試劑盒，分析受納米基因顆粒轉(zhuǎn)染后，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的濃度。并且將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞共孵育，次日檢測(cè)其N(xiāo)K細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞頻率的改變，以及其活化的情況。最后，給C57BL6小鼠背部皮下接種黑色瘤細(xì)胞B16BL6-MICA，成瘤5日后，分別注射PBS，殼聚糖，肌肉注射，瘤內(nèi)注射，持續(xù)三周，每天記錄荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，以及小鼠的生存狀況。處死小鼠后，通過(guò)FCM檢測(cè)并分析小鼠脾臟NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)

6、胞的頻率以及CD69、NKG2D和CD44的表達(dá)。
　　結(jié)果:該納米材料能夠裝載入pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因，并且包封率可達(dá)到92.8±0.37％。該納米基因顆粒在較高濃度時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的毒性。該納米顆粒具備轉(zhuǎn)運(yùn)重組基因dsNKG2D-IL-15至細(xì)胞的能力，且FCM以及ELISA檢測(cè)證實(shí)，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染該納米顆粒后，胞漿內(nèi)NKG2D與IL-15均表達(dá)。該納米顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)CD69

7、，并上調(diào)CD8+T細(xì)胞表面NKG2D和CD44的表達(dá)。另外，荷瘤小鼠經(jīng)該納米基因顆粒處理后，明顯抑制移植瘤的生長(zhǎng)、且延長(zhǎng)小鼠的生存期。
　　結(jié)論:裝載pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因的納米顆?？杀患?xì)胞吞噬并表達(dá)dsNKG2D-IL-15融合蛋白。該納米基因顆粒體內(nèi)使用后，可通過(guò)激活NK和CD8+T細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗腫瘤活性。
　　2.裝載dsNKG2D-IL-15重組蛋白的納米顆粒制備及其抗腫瘤活性

8、>　　目的:通過(guò)HTCC修飾的殼聚糖以及前期制備的dsNKG2D-IL-15融合蛋白，制備裝載待重組蛋白的納米顆粒。體外檢測(cè)該納米顆粒的理化性質(zhì)和細(xì)胞毒性，體內(nèi)注射荷瘤小鼠，觀察該納米顆粒的抗腫瘤效果。
　　方法:利用配制好的HTCC殼聚糖，以及課題組前期制備的dsNKG2D-IL-15重組蛋白，制備負(fù)載融合蛋白的抗腫瘤納米顆粒。取裝載混合物上清，使用分光光度計(jì)檢測(cè)游離蛋白濃度，按照下列公式計(jì)算包封率:（總蛋白量-游離蛋白量）/總

9、蛋白量×100％。用動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米顆粒的粒徑，以及納米顆粒表面的Zeta電位。使用MTS/PMS試劑盒檢測(cè)該納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性作用，并通過(guò)透析和蛋白凝膠電泳檢測(cè)納米顆粒中蛋白的釋放。最后，給C57BL/6小鼠背部皮下接種B16BL6-MICA黑色素瘤細(xì)胞，成瘤5天后，分別給每組小鼠注射生理鹽水(PBS)，殼聚糖(HTCC)溶液，制備好的納米顆粒以及單體重組蛋白。持續(xù)3周，每天記錄小鼠生存狀況，以及腫瘤生長(zhǎng)的情況。處死小鼠后，分析

10、荷瘤小鼠脾臟NK和CD8+T細(xì)胞頻率的改變和活化狀態(tài)。
　　結(jié)果:HTCC殼聚糖溶液可包裹溶液中的dsNKG2D-IL-15重組蛋白，且質(zhì)量比為1∶1時(shí)最高，達(dá)到95.3％。粒徑大小在200 nm左右，表面帶5.3 mV正電荷。該納米凝膠對(duì)B16BL6等腫瘤細(xì)胞有一定毒性，而對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7毒性相對(duì)較小。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，能夠在24小時(shí)有效釋放重組蛋白。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，該納米顆粒治療組與PBS以及殼聚糖對(duì)照組相比，在C