倍他環(huán)糊精修飾的載阿霉素聚合物膠束的構(gòu)建及抗腫瘤作用研究.pdf

1、臨床上用于抗腫瘤治療的許多藥物由于溶解性能較差，毒副作用嚴(yán)重以及使用過程中腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥而導(dǎo)致其應(yīng)用受到很大的限制，新型藥物傳遞系統(tǒng)的開發(fā)為提高藥物抗腫瘤效果提供了新的思路。本文主要研究?jī)?nèi)容是通過兩親聚合物膠束結(jié)合β-環(huán)糊精(β-CD)對(duì)疏水性藥物的包合作用，構(gòu)建新型藥物膠束傳遞系統(tǒng)，提高對(duì)疏水性藥物的包載能力，達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥效果。β-CD擁有眾多羥基，能夠進(jìn)行化學(xué)修飾，我們選擇在其伯羥基位上鏈接兩親性的聚合物鏈，從而得

2、到兩親性環(huán)糊精聚合物，在此基礎(chǔ)上修飾葉酸小分子靶向基團(tuán)，優(yōu)化載體結(jié)構(gòu)，獲得具有腫瘤主動(dòng)靶向能力以及具有良好耐藥逆轉(zhuǎn)作用的給藥系統(tǒng)，通過對(duì)構(gòu)建的膠束載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制的深入研究，為提高抗腫瘤藥物化療效果提供新平臺(tái)和新思路。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、乓跃垡叶紗渭酌?mPEG)為親水鏈，聚乳酸(PLA)或聚己內(nèi)酯(PCL)為疏水鏈合成兩嵌段共聚物，與β-CD伯羥基位相連得到基于β-CD的兩親性聚合物膠束聚乙二醇-聚乳酸-環(huán)糊精(P

3、ELA-CD)或聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-環(huán)糊精(PECL-CD)。表征合成得到的聚合物，考察其在水溶液中的膠束化行為，聚合物膠束粒徑分布在100～200nm左右，CMC值在0.0016～0.01g/L之間。
　?、埔钥鼓[瘤藥物阿霉素為模型藥物一，用乳化溶劑揮發(fā)法獲得載藥的聚合物膠束。比較β-CD、PEG-CD、PELA、PELA-CD膠束的載藥情況，所合成的PELA-CD、PECL-CD膠束載藥量普遍高于β-CD、PEG-CD、PEL

4、A，其中PELA54-CD、PECL54-CD的載藥量最大，說明β-CD經(jīng)聚合物修飾改性后更利于負(fù)載DOX。PLA疏水鏈段的加入，使得膠束結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，與β-CD的疏水區(qū)域共同增加對(duì)疏水性阿霉素的包載。包載阿霉素后膠束的粒徑主要集中在100～160nm之間，并且具有較窄的分布。載藥膠束內(nèi)DOX的釋放具有一定的特點(diǎn)性，即在pH7.4的生理?xiàng)l件下釋放緩慢，而在pH5.5的酸性條件下釋放加快，有利于膠束在腫瘤部位發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。以多烯紫杉醇

5、為模型藥物二，建立了DTX的測(cè)定方法，其精密度高，系統(tǒng)適應(yīng)性符合要求。通過考察不同載藥方法得到的膠束載藥量、粒徑等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)薄膜水化法操作簡(jiǎn)便，易控制藥物濃度，且得到的膠束包封率高、粒徑在80～120 nm，透射電鏡觀察膠束形態(tài)，形狀規(guī)整成球形?？疾觳煌杷湺伪壤腜ELA-CD對(duì)載藥量的影響，當(dāng)親疏水鏈段比例為5∶4時(shí)膠束具有最大載藥量和包封率。連接β-CD之后的膠束載藥量與PELA膠束相比并無明顯的提高，因此，無需通過環(huán)糊精來改善

6、兩嵌段聚合物膠束對(duì)DTX的包載性能。以上結(jié)果表明構(gòu)建的基于β-CD的聚合物膠束體系可廣泛應(yīng)用于疏水性藥物的包載。
　　⑶在PEG-PLA-β-CD的基礎(chǔ)上，引入小分子葉酸(FA)，構(gòu)建同時(shí)具有主動(dòng)和被動(dòng)靶向作用的聚合物載阿霉素體系FA-PELA-CD/DOX。PLA疏水鏈段與β-環(huán)糊精的疏水區(qū)域共同增加對(duì)疏水性阿霉素的包載，葉酸修飾并未改變藥物釋放特性。在高表達(dá)葉酸受體的HeLa細(xì)胞上，藥物攝取明顯增多，對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性也顯著增強(qiáng)

7、。PEG修飾，延長(zhǎng)了體循環(huán)時(shí)間，EPR效應(yīng)增強(qiáng)被動(dòng)靶向作用以及腫瘤部位藥物滯留時(shí)間，近紅外成像實(shí)驗(yàn)顯示葉酸膠束給藥10天后腫瘤部位仍具有最高的藥物量。腫瘤組織切片結(jié)果顯示與游離藥物組相比，聚合物膠束組可以造成腫瘤細(xì)胞的不可避免的以及時(shí)間依賴性的損傷。葉酸修飾使聚合物膠束具有主動(dòng)靶向作用，在增強(qiáng)載藥膠束系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性的同時(shí)能夠減少對(duì)心臟的毒副作用。上述機(jī)制的共同作用最終實(shí)現(xiàn)了FA-PELA-CD/DOX對(duì)裸鼠KB細(xì)胞移植瘤86％的抑制

8、效果。
　　⑷體外細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)以及斑馬魚體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)載藥膠束PELA-CD/DOX和PECL-CD/DOX可以增強(qiáng)DOX對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的毒性。體外細(xì)胞毒性結(jié)果顯示載藥聚合物膠束PELA54-CD/DOX的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)到了8.82倍，PEG、PLA或PCL與β-CD的結(jié)合能夠顯著增強(qiáng)耐藥逆轉(zhuǎn)效果。此外載藥聚合物膠束PELA54-CD/DOX對(duì)斑馬魚體內(nèi)MCF-7/ADR腫瘤的抑制取得了很好的效果，高劑量組腫

9、瘤抑制率達(dá)到64％，同時(shí)載藥膠束緩解了阿霉素的心臟毒性。體外細(xì)胞對(duì)P-gp底物R123的攝取實(shí)驗(yàn)與斑馬魚體內(nèi)羅丹明B滯留實(shí)驗(yàn)均表明PELA-CD和PECL-CD膠束可以提高P-gp底物在MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)的滯留，減少P-gp對(duì)底物的外排。通過ATP耗竭實(shí)驗(yàn)、ATP酶活性實(shí)驗(yàn)、LDH檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位檢測(cè)、細(xì)胞P-gp蛋白和MDR1基因表達(dá)檢測(cè)等系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚合物膠束逆轉(zhuǎn)P-gp的作用機(jī)制為:通過耗竭細(xì)胞內(nèi)ATP、減少

10、細(xì)胞P糖蛋白的表達(dá)以及作為底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合P-gp從而減少抗腫瘤藥物的外排，最終實(shí)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)。聚合物分子中三個(gè)組分對(duì)阿霉素的構(gòu)效關(guān)系具有重要的影響。
　　⑸本研究構(gòu)建了基于β-CD的聚合物膠束藥物傳遞體系，能夠提高對(duì)疏水性藥物的包載能力;利用FA對(duì)膠束進(jìn)行修飾，使之具有腫瘤主動(dòng)靶向性，增強(qiáng)抑瘤效果的同時(shí)減少了DOX的毒副作用;通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)總結(jié)聚合物膠束PELA-CD逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，建立了一套較為完整的P-gp作用機(jī)制的評(píng)