整合素αvβ6在SDF-1-CXCR4介導的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用有分子機制研究.pdf

1、研究背景和意義:
　　結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升且死亡率居高不下，嚴重危害著人民群眾的健康，成為世界腫瘤研究領(lǐng)域的一大難題。結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移是影響其預后的主要因素，表現(xiàn)出明顯的組織器官特異性，肝、肺、淋巴結(jié)是其主要轉(zhuǎn)移部位，其中肝轉(zhuǎn)移最為常見，是導致結(jié)腸癌患者死亡的主要原因。傳統(tǒng)觀點認為結(jié)腸癌細胞經(jīng)門靜脈回流肝臟時運動變慢，容易在此停留和生長。但近年來越來越多的研究表明，這一現(xiàn)象并不能單純由解剖結(jié)構(gòu)和血液、

2、淋巴引流來解釋，應該還有其他因素參與，但這些因素及其具體機制目前還不清楚。
　　趨化因子是一類具有趨化作用的小分子量細胞因子，其相應受體為G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體，二者的相互作用可以介導多種免疫細胞（如淋巴細胞、樹突狀細胞等）循其濃度梯度做定向遷移，在組織發(fā)育、淋巴歸巢、機體免疫、炎癥反應等諸多過程中發(fā)揮重要作用。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明趨化因子及其受體與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系。趨化因子及其受體在腫瘤器官選擇

3、性轉(zhuǎn)移中的作用機制類似于其介導的免疫細胞向淋巴組織的歸巢過程，即趨化因子與其受體結(jié)合后，腫瘤細胞運動能力增強，并循趨化因子濃度梯度向趨化因子富集器官做定向運動，最終完成腫瘤的定向轉(zhuǎn)移。CXCR4是腫瘤細胞中表達最普遍的趨化因子受體之一，在結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中均有較高的表達率，趨化因子SDF-1是其唯一配體，二者相互作用構(gòu)成SDF-1/CXCR4生物軸在腫瘤細胞的定向遷移過程中發(fā)揮重要作用。而且肝、肺、淋巴結(jié)等

4、結(jié)腸癌好發(fā)轉(zhuǎn)移部位均為SDF-1表達豐富的器官組織，提示SDF-1/CXCR4在結(jié)腸癌器官特異性轉(zhuǎn)移中具有重要作用，然而其具體作用機制仍不清楚。
　　結(jié)腸癌的組織器官特異性轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復雜過程。一方面，結(jié)腸癌細胞的定向轉(zhuǎn)移需要有一定的“方向性”。而SDF-1的濃度梯度可以為其提供“方向?qū)Ш健?，即CXCR4陽性的結(jié)腸癌細胞可以循著SDF-1的濃度梯度，向富含SDF-1的組織器官定向遷移;另一方面，結(jié)腸癌細胞的定向轉(zhuǎn)移需要一定的

5、“動力”。既往研究表明SDF-1/CXCR4本身并不直接參與細胞的粘附及遷移運動，而可能通過向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導信號，激活其他分子，促進細胞的遷移粘附。因此我們認為，與細胞遷移、粘附直接相關(guān)的粘附分子可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　整合素屬于細胞表面粘附分子家族，是一類由α亞基和β亞基以非共價鍵結(jié)合組成的跨膜糖蛋白受體。整合素可以介導細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)的粘附反應，通過向細胞內(nèi)外傳導生物學信號，調(diào)控細胞的生物學行為。整合素αvβ6是一類

6、僅存在于上皮源性惡性腫瘤的特殊整合素亞型，與多種上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而其作為一種抗惡性上皮性腫瘤的靶目標，已成為該領(lǐng)域的研究熱點之一。課題組通過十余年的系統(tǒng)研究表明:整合素αvβ6與結(jié)腸癌和胃癌的病理類型、分化程度和病理分期密切相關(guān)，可作為結(jié)腸癌和胃癌的獨立不良預后指標;αvβ6與ERK之間存在直接連接，結(jié)腸癌細胞通過αvβ6-ERK信號通路調(diào)控uPA、MMP-9和MMP-2的分泌及活性，激活纖溶酶原系統(tǒng)降解細胞外基

7、質(zhì)，使腫瘤細胞獲得高侵襲性表型;在結(jié)腸癌細胞中，整合素αvβ6持續(xù)的進行內(nèi)吞胞吐循環(huán)，而αvβ6正是通過自身的內(nèi)吞胞吐循環(huán)，直接參與腫瘤細胞的遷移運動。
　　由此可見，SDF-1/CXCR4介導的結(jié)腸癌定向轉(zhuǎn)移是多因素相互作用的結(jié)果，而目前關(guān)于其作用機制的研究多局限于SDF-1/CXCR4生物軸本身及其下游信號通路，SDF-1/CXCR4與其他分子特別是粘附分子相互作用的研究則很少，尤其與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的αvβ6在其中的作用目

8、前更是未見相關(guān)研究。
　　本項目擬通過臨床標本和細胞實驗，明確CXCR4和αvβ6在結(jié)腸癌組織和不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞中的表達情況及其與結(jié)腸癌臨床病理特征特別是器官特異性轉(zhuǎn)移的關(guān)系，分析二者之間的表達相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上進一步探討αvβ6在SDF-1/CXCR4介導的結(jié)腸癌定向轉(zhuǎn)移中的可能作用及具體分子機制，從而為解釋結(jié)腸癌細胞的肝臟特異性轉(zhuǎn)移提供一種新型的理論機制。如能在這一新型調(diào)節(jié)機制中找到一個或多個關(guān)鍵作用靶點，進行針對性

9、干預，將會有效減少結(jié)腸癌的遠處轉(zhuǎn)移，改善患者預后，對于結(jié)腸癌的綜合治療具有十分重要的實際意義和臨床應用前景。
　　第一部分:αvβ6和CXCR4在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細胞中的表達情況
　　目的:
　　明確整合素αvβ6和CXCR4對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響及二者表達情況的相關(guān)性。
　　方法:
　　收集2005年～2008年間在山東大學齊魯醫(yī)院由同一手術(shù)團隊行結(jié)腸癌根治術(shù)的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織及肝轉(zhuǎn)移組織標本，并進行

10、相關(guān)資料的采集和隨訪;資料采集內(nèi)容包括:性別和年齡等一般資料，腫瘤大小、病理類型、分化程度，TNM分期，手術(shù)方式，以及臟器和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預后情況;然后利用免疫組織化學方法檢測病理組織中αvβ6、CXCR4的表達部位、陽性表達率及表達強度，并進行免疫組化評分;在此基礎(chǔ)上結(jié)合相關(guān)臨床隨訪資料，統(tǒng)計分析αvβ6和CXCR4在結(jié)腸癌組織和肝轉(zhuǎn)移組織中的表達情況及其對肝轉(zhuǎn)移等結(jié)腸癌預后情況的影響;并進一步利用Mann-Whitneytest和Sp

11、earman等級相關(guān)分析等統(tǒng)計方法初步探討αvβ6和CXCR4的表達相關(guān)性。選取高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞系HT-29和WiDr以及非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細胞系Caco-2作為研究對象;逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測β6亞基和CXCR4在各細胞系中的mRNA表達水平;Westernblot檢測β6亞基和CXCR4在各細胞系中的蛋白表達水平;流式細胞術(shù)檢測整合素αvβ6和CXCR4在各細胞表面的表達情況。
　　結(jié)果:
　　159例符合要

12、求的結(jié)腸癌患者被納入本研究，共收集了159例原發(fā)結(jié)腸癌組織和21例肝轉(zhuǎn)移組織。通過對159例原發(fā)結(jié)腸癌組織進行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，CXCR4和αvβ6分別在在107例(67.3％)和73例(45.9％)結(jié)腸癌組織中表達陽性，而二者在正常結(jié)腸組織中幾乎無表達;通過對21例肝轉(zhuǎn)移組織進行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，CXCR4和αvβ6分別在19例(90.5％)和16例(76.2％)肝轉(zhuǎn)移組織中表達陽性，而二者在正常肝臟組織中幾乎無表達;CXCR4表達與

13、結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p＜0.05)、TNM分期(p＜0.05）和肝轉(zhuǎn)移(p＜0.01）密切相關(guān);αvβ6表達與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p＜0.05)、TNM分期(p＜0.05)、淋巴血管侵犯(p＜0.05)和肝轉(zhuǎn)移密切(p＜0.01)相關(guān);αvβ6和CXCR4均高表達的患者，與二者表達情況的其他組合相比，更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p＜0.05)和肝臟轉(zhuǎn)移(p＜0.01);Mann-Whitneytest和Spearman等級相關(guān)分析表明，αvβ

14、6和CXCR4的表達呈正相關(guān)性。細胞實驗表明，β6亞基和CXCR4的mRNA和蛋白表達水平在HT-29和WiDr細胞系中均相對較高，而在Caco-2細胞系中的表達水平很低;整合素αvβ6和CXCR4在HT-29和WiDr細胞表面的表達水平相對較高，而在Caco-2細胞表面幾乎無表達或表達較低。
　　結(jié)論:
　　整合素αvβ6和CXCR4與結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且二者的表達具有一定的相關(guān)性。二者均在高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞中高

15、表達，而在非轉(zhuǎn)移性的細胞中低表達，而且二者均高表達的患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
　　意義:
　　該部分證實了整合素αvβ6和CXCR4與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系，為進一步探討αvβ6和CXCR4參與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的具體機制奠定了實驗基礎(chǔ)并提供了一定的理論前提。
　　第二部分:SDF-1/CXCR4對αvβ6及其他整合素表達的影響
　　目的:
　　探討SDF-1/CXCR4對αvβ6及其他常見整合素表達的影響及其具體

16、機制。
　　方法:
　　利用實時定量PCR、westernblot檢測SDF-1/CXCR4對HT-29和WiDr細胞中αv、β1、β3、β5和β6亞基表達的影響;流式細胞術(shù)檢測SDF-1/CXCR4對細胞表面αvβ6表達的影響;westernblot檢測SDF-1/CXCR4對ERK1/2磷酸化的影響，并觀察ERK抑制劑U0126對αvβ6表達和HT-29細胞定向遷移的影響;westernblot、共聚焦顯微鏡檢測SDF-

17、1/CXCR4對Ets-1活化的影響，并觀察Ets-1特異性siRNA對αvβ6表達和HT-29細胞定向遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　實時定量PCR、westernblot結(jié)果表明SDF-1/CXCR4在HT-29和WiDr細胞中可明顯增加β6亞基的表達、輕度增加β1亞基的表達，而對αv、β3、β5亞基的表達無影響;流式細胞術(shù)顯示SDF-1/CXCR4可明顯增加HT-29和WiDr細胞表面αvβ6的表達;SDF-1/CXCR

18、4可促進ERK1/2的磷酸化，而ERK抑制劑U0126則可顯著抑制SDF-1/CXCR4介導的αvβ6表達上調(diào)和HT-29細胞定向遷移;SDF-1/CXCR4可促進Ets-1的活化，而Ets-1特異性siRNA則可顯著抑制SDF-1/CXCR4介導的αvβ6表達上調(diào)和HT-29細胞定向遷移。
　　結(jié)論:
　　SDF-1/CXCR4可通過ERK-Ets-1通路促進整合素αvβ6的表達增加。
　　意義:
　　明確了S

19、DF-1/CXCR4對αvβ6表達的影響及具體機制，從而為下一步明確αvβ6在SDF-1/CXCR4介導的定向轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分:αvβ6在SDF-1/CXCR4介導的結(jié)腸癌細胞定向遷移中的作用
　　目的:
　　明確整合素αvβ6在SDF-1/CXCR4介導的結(jié)腸癌細胞定向遷移中的作用。
　　方法:
　　在Transwell小室的下室加入一定濃度的SDF-1作為趨化物，分別檢測HT

20、-29和WiDr細胞在纖連蛋白表面的定向遷移能力;對HT-29和WiDr細胞分別給予三種干預手段，即αvβ6功能阻斷抗體10D5、αvβ6特異性siRNA以及CXCR4特異性阻斷劑AMD3100，觀察各干預手段對結(jié)腸癌細胞定向遷移能力的影響。CXCR4過表達質(zhì)粒pcDNA-CXCR4轉(zhuǎn)染非轉(zhuǎn)移性細胞系Caco-2;利用含綠色熒光蛋白的表達質(zhì)粒pcDNA-GFP驗證轉(zhuǎn)染效率，利用westernblot和流式細胞術(shù)驗證CXCR4的過表達效果

21、;200ng/mlSDF-1刺激轉(zhuǎn)染了pcDNA-CXCR4的Caco-2細胞，利用實時定量PCR、westernblot和流式細胞術(shù)檢測SDF-1對αvβ6表達的影響;遷移實驗檢測過表達CXCR4對Caco-2細胞定向遷移能力的影響，并通過干擾αvβ6觀察αvβ6在此過程中的作用。
　　結(jié)果:
　　與對照組(Transwell小室的下室不加趨化物SDF-1)相比，SDF-1能明顯增加HT-29和WiDr細胞在纖連蛋白表面的

22、定向遷移能力;10D5、αvβ6特異性siRNA、AMD3100可顯著抑制SDF-1誘導的定向遷移。pcDNA的轉(zhuǎn)染效率大于80％，pcDNA-CXCR4可有效增加Caco-2細胞中CXCR4的表達水平;SDF-1可明顯上調(diào)轉(zhuǎn)染pcDNA-CXCR4的Caco-2細胞中αvβ6的表達，而CXCR4特異性抑制劑AMD3100可有效抑制SDF-1誘導的αvβ6表達上調(diào);過表達CXCR4可顯著增加Caco-2細胞的定向遷移能力，而同時應用αv