非Smad通路在小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、第一部分CT26-Smad4KD細(xì)胞系的建立及鑒定
　　目的:建立CT26-Smad4KD穩(wěn)定細(xì)胞系并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法:選用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26作為研究對(duì)象。以已被文獻(xiàn)驗(yàn)證的有效shRNA序列為干擾序列并使用通用陰性對(duì)照序列,分別構(gòu)建vshRNA載體。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包被慢病毒顆粒。在野生型CT26細(xì)胞系中,采用慢病毒感染的方式建立Smad4干擾組以及相應(yīng)的空載體對(duì)照組。使用puromycin篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆。以west

2、ernblot和Co-immunoprecipitation檢測(cè)上述細(xì)胞克隆中Smad4蛋白的表達(dá)情況及Smad2/3/4復(fù)合物的形成情況。并對(duì)非Smad通路中MAPK通路進(jìn)行初步檢測(cè)。結(jié)果:在含polybrene5μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基做溶媒,MOI=50時(shí),慢病毒在CT26細(xì)胞感染效率最高。經(jīng)westernblot檢測(cè),野生型CT26細(xì)胞和陰性對(duì)照克隆均正常表達(dá)Smad4,干擾組中,Smad4KD＃1、Smad4KD＃

3、8和Smad4KD＃18克隆的Smad4表達(dá)下降明顯,干擾效果好。經(jīng)Co-immunoprecipitation檢測(cè),無(wú)論是否給予外源性TGF-β,CT26-Smad4KD細(xì)胞系均不能形成正常水平的Smad2/3/4復(fù)合物。結(jié)論:成功建立CT26-Smad4KD細(xì)胞系及其陰性對(duì)照。
　　第二部分:干擾Smad4抑制CT26細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡
　　目的:探討Smad4蛋白在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中的作用。方法:選用小鼠結(jié)腸癌細(xì)

4、胞系CT26、其陰性對(duì)照NC及敲減Smad4的細(xì)胞系CT26-Smad4KD作為研究對(duì)象。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn),觀察及比較野生型CT26細(xì)胞、陰性對(duì)照組及Smad4KD細(xì)胞的生存曲線,以及在給予外源性TGF-β條件下,其細(xì)胞增殖能力。然后,通過(guò)軟瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)野生型CT26細(xì)胞在敲減Smad4蛋白后,其在半固態(tài)懸浮環(huán)境中的非錨定增殖能力。接下來(lái),我們使用AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)在流式細(xì)胞儀上比較野生型CT

5、26細(xì)胞干擾Smad4蛋白前后,在細(xì)胞凋亡的改變。最后,我們?cè)贐alb/c-nu鼠進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。我們將野生型CT26與Smad4KD細(xì)胞分別注射到Balb/c-nu鼠皮下,觀察其體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果:CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在未給予外源性TGF-β條件下,干擾Smad4后,CT26細(xì)胞的增殖能力在第48h開(kāi)始,較野生組和陰性對(duì)照組有明顯降低;而陰性對(duì)照組與野生型則嗚顯著差異。干擾Smad4后,CT26細(xì)胞的增殖能力下降了約25％,而陰性

6、對(duì)照NC組無(wú)明顯變化。而給予外源性TGF-β刺激時(shí),野生型CT26、陰性對(duì)照NC組及Smad4KD三組細(xì)胞之間增殖無(wú)顯著性差異。Smad4蛋白在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的增殖中起促進(jìn)作用,并且干擾Smad4蛋白之后,細(xì)胞對(duì)外源性TGF-β的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)失去應(yīng)答。然后,軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,敲減Smad4的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的克隆形成明顯比野生型及陰性對(duì)照組的細(xì)胞少,而且所形成的克隆直徑也小于野生型和陰性對(duì)照組。AnnexinV-

7、FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提示,與野生型CT26及其陰性對(duì)照組相比,Smad4KD細(xì)胞活細(xì)胞百分比明顯降低,早其凋亡及死亡細(xì)胞顯著增加。而給予外源性TGF-β之后,野生型CT26細(xì)胞、陰性對(duì)照及Smad4KD細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比未有明顯變化。而皮下成瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示,與野生型CT26細(xì)胞所成皮下腫瘤相比,Smad4KD形成的皮下瘤塊明顯較小。野生型CT26所成皮下腫瘤體積為5865.73±1630.00mm3,而Smad4KD所成皮下

8、腫瘤體積為955.37±297.96mm3。干擾Smad4使CT26細(xì)胞所形成的皮下腫瘤體積顯著減小。結(jié)論:干擾Smad4抑制CT26細(xì)胞增殖及克隆形成,促進(jìn)其凋亡。
　　第三部分:干擾Smad4促進(jìn)CT26細(xì)胞的遷移能力
　　目的:探討Smad4蛋白在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型中的作用。方法:我們以小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26、陰性對(duì)照細(xì)胞及CT26-Smad4KD細(xì)胞作為研究對(duì)象,利用劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲

9、實(shí)驗(yàn),評(píng)估野生型CT26細(xì)胞、陰性對(duì)照組及Smad4KD細(xì)胞的橫向爬行能力、縱向遷移及侵襲能力。然后,我們結(jié)合TGF-β與MAPK/JNK抑制劑SP600125,以及MAPK/ERK抑制劑PD98059和U0126,使用transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究Smad4KD細(xì)胞在阻斷JNK或ERK通路后,其縱向遷移能力的變化。結(jié)果:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,劃痕36小時(shí)后,給予外源性TGF-β后,野生型CT26細(xì)胞向無(wú)細(xì)胞區(qū)爬行增多;而Smad4KD

10、細(xì)胞在未給予外源性TGF-β條件下,其細(xì)胞側(cè)向爬行能力已經(jīng)明顯超過(guò)野生型CT26細(xì)胞,給予外源性TGF-β刺激后,爬行能力明顯增強(qiáng)。此后,transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鋪細(xì)胞24小時(shí)后,野生型CT26細(xì)胞每個(gè)高倍視野下,穿過(guò)8um的transwell膜細(xì)胞數(shù)目為23.4±13.13個(gè),兩個(gè)陰性對(duì)照克隆穿過(guò)數(shù)分別為24.43±11.43和23.85±15.89個(gè)。而敲減Smad4后,其穿過(guò)能力明顯增強(qiáng),三個(gè)Smad4KD細(xì)胞克隆