攜帶干擾素-β基因的腺病毒治療結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 轉(zhuǎn)移性肝癌也稱繼發(fā)性肝癌，屬于惡性腫瘤晚期的表現(xiàn)。肝臟由于有肝動脈、門靜脈雙重血供，故許多臟器的惡性腫瘤易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移性肝癌，在首次確診或復發(fā)時約40～50％存在肝轉(zhuǎn)移，其主要途徑為經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)移。腎癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、惡性黑色素瘤等則可經(jīng)肝動脈轉(zhuǎn)移入肝。尸檢表明，我國轉(zhuǎn)移性肝癌為原發(fā)性肝癌的1.2倍，歐美則為20倍，近年來此病的發(fā)生率還在逐年上升。對轉(zhuǎn)移性肝癌治療的效果直接

2、影響患者生存質(zhì)量和生存期，但轉(zhuǎn)移性肝癌又是腫瘤治療中十分棘手的難題。雖然目前各種治療方法較多，但仍無法從根本上改變轉(zhuǎn)移性肝癌的預后。隨著肝臟外科技術(shù)及圍手術(shù)期處理水平的提高，肝切除術(shù)目前被認為是結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移唯一能夠獲得長期生存的治療手段，其3年生存率可達50％。但僅僅只有不到1/4的患者適合手術(shù)治療。即使是肝臟轉(zhuǎn)移瘤切除術(shù)后，最終仍有60％～70％的患者出現(xiàn)不同部位的復發(fā)。傳統(tǒng)的治療方法(如單純靜脈化療)對轉(zhuǎn)移性肝癌并不能夠顯著延長患者

3、的生存期。雖然近年來聯(lián)合靜脈化療和靶向藥物治療的研究獲得可喜進展，使得整體療效有了很大改善，但化療引起的不良反應(yīng)和腫瘤細胞對化療藥物的耐藥、靶向藥物費用高昂都限制了這些藥物在臨床的廣泛使用。
　　 最近的研究資料顯示干擾素-β具有較強的抗腫瘤作用。體外研究發(fā)現(xiàn)干擾素-β具有抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的作用。在一項抑制黑色素瘤細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，干擾素β與干擾素α2相比在誘導腫瘤細胞凋亡的作用更強，其機制可能與TRAIL

4、/Apo2L相關(guān)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)干擾素β可抑制腫瘤血管生成，其作用機制可能是通過抑制VEGF、MMP9等血管生成因子的基因編碼直接抑制腫瘤血管形成。而腫瘤血管形成在轉(zhuǎn)移性肝癌的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。這為使用干擾素β對腫瘤進行治療提供了依據(jù)，但是由于單純使用干擾素β治療存在半衰期較短，需要大劑量頻繁給藥，使得很多患者不能耐受，故很難直接用于臨床使用。為克服上述問題，有研究證實使用腺病毒載體的干擾素-β基因治療在包括卵巢癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、

5、肺癌取得較好效果。
　　 基因治療是一種新型的治療疾病的方法，它通過載體把正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕?qū)氚屑毎蛏矬w內(nèi)，從而達到治療疾病的目的。近年來，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被作為一種較常用的基因轉(zhuǎn)移工具應(yīng)用于基因治療及其他研究領(lǐng)域。本實驗以IFN-β基因為目的基因，利用復制缺陷型腺病毒作為基因治療的載體，同時建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，經(jīng)腹腔注射給藥的方式，觀察INF-β基因治療結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的療效。
　　 研究方法和結(jié)

6、果
　　 一、攜帶IFN-β腺病毒載體的構(gòu)建和鑒定
　　 將IFN-β基因插入到含有CMV啟動子的腺病毒載體pIRES2-EGFP中獲得腺病毒穿梭載體pIRES2-EGFP-IFNB，使用Invitrogen的BP重組系統(tǒng)將目的片段IFNβ-IRES-EGFP重組到中間載體pDONR221上，經(jīng)純化擴增后再將pDONR221-IFNβ-IRES-EGFP中間載體上攜帶的目的片段重組到腺病毒載體pAd/CMWV5-DEST

7、。而后經(jīng)293細胞包裝，收獲病毒液純化，提取病毒基因組進行PCR鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為AdIFN-β-EGFP。經(jīng)293細胞擴增、氯化銫(CsCl)密度梯度離心純化、TCID50測得病毒AdIFN-β-EGFP滴度為5.25×108TCID50/ml。
　　 二、表達IFN-β的腺病毒對小鼠結(jié)腸癌細胞(C26)的體外作用研究
　　 (一)用AdIFN-β-EGFP和AdEGFP分別以MOI值=20、50、100、2

8、00感染C26細胞，48h后熒光顯微鏡下計算轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染效率隨著MOI值的升高而提高，20、50、100及200MOI值的AdIFN-β-EGFP對C26細胞的轉(zhuǎn)染率分別為18％、45％、95％、99％。
　　 (二)ELISA方法定量檢測腺病毒AdIFN-β-EGFP感染C26細胞后IFN-β蛋白的表達。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)可以得出當MOI=100時，2d、4d、6d和8d測得IFN-β的表達量為915.18±407.40p

9、g/ml。
　　 (三)MTT比色法檢測AdIFN-β-EGFP和AdEGFP轉(zhuǎn)染C26細胞對細胞生長的影響。用AdIFN-β-EGFP和AdEGFP分別以MOI值=100感染C26細胞，分別轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h進行MTT檢測并繪制細胞生長曲線圖。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，AdEGFP對C26細胞的增殖無明顯影響，AdIFN-β-EGFP有抑制C26細胞增殖的作用，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(p<0.05)。
　　 (四)流式

10、細胞儀檢測AdIFN-β-EGFP和AdEGFP轉(zhuǎn)染C26細胞48小時后對細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AdIFN-β-EGFP后細胞凋亡數(shù)顯著增加，轉(zhuǎn)染AdEGFP未發(fā)現(xiàn)明顯細胞凋亡。
　　 (五)劃痕實驗和細胞體外遷移能力實驗(Transwell)觀察AdIFN-β-EGFP和AdEGFP轉(zhuǎn)染C26細胞后對細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染AdIFN-β-EGFP后C26細胞與轉(zhuǎn)染AdEGFP和空白對照組比較遷移能力顯著降低。轉(zhuǎn)

11、染AdEGFP和空白對照組相比無明顯差別。
　　 三、表達IFN-β的腺病毒對轉(zhuǎn)移性肝癌的體內(nèi)實驗研究
　　 (一)ELISA方法檢測腺病毒AdIFNβ-EGFP和AdEGFP分別感染經(jīng)腹腔注射到小鼠體內(nèi)后IFN-β表達量。注射后分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10d斷尾取血，檢測血清中IFNβ的表達量。結(jié)果顯示，注射后1天小鼠體內(nèi)便可檢測到IFNβ，注射3-4天內(nèi)表達持續(xù)在一個較高水平，10天是表達基本消失，

12、對照組未能檢測到IFNβ明顯增高。
　　 (二)IFN-β基因治療對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用，首先建立小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型，共分4組，其中3組分別于術(shù)后第3、第9天，腹腔注射PBS、AdIFN-β-EGFP、AdEGFP；另一組在術(shù)后第3、6、9天腹腔注射0.8mg5-FU生理鹽水溶液1ml。治療結(jié)束第3天，取出小鼠肝臟分別肉眼觀察肝臟表面腫瘤數(shù)目及大??；病理切片染色在顯微鏡下觀察肝內(nèi)腫瘤數(shù)目及大小，進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明Ad

13、IFN-β-EGFP治療組和5-FU組小鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目及大小均小于PBS組及AdEGFP，且具有統(tǒng)計學差異。但AdIFN-β-EGFP治療組和5-FU組未顯示有顯著差異。
　　 (三)IFN-β基因治療對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠生存期的影響，經(jīng)AdIFN-β-EGFP治療組和5-FU組小鼠生存期明顯延長，與PBS組及AdEGFP比較，差異具有統(tǒng)計學意義。但AdIFN-β-EGFP治療組和5-FU組的小鼠生存期比較，差異無統(tǒng)計學意義。<

14、br>　　 結(jié)論
　　 本課題成功構(gòu)建了攜帶IFN-β基因復制缺陷型腺病毒AdIFN-β-EGFP，該病毒能夠高效感染小鼠結(jié)腸癌細胞株(C26)，在體外能夠明顯抑制C26細胞生長；促進腫瘤細胞凋亡；降低腫瘤細胞遷移能力。腹腔注射AdIFN-β-EGFP在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠體內(nèi)能夠表達較高濃度的IFN-β，與對照組比較能夠顯著抑制小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的生長和延長小鼠生存期。但與5-FU腹腔化療組比較并未顯示出明顯優(yōu)勢。兩種治療方法是