攜帶凋亡素VP3基因重組腺病毒的制備及其在人結(jié)腸癌SW480細胞中的表達.pdf

1、目的：利用細菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒,為凋亡素VP3基因在治療結(jié)腸癌方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：設(shè)計VP3 cDNA擴增引物,從PET15b-VP3質(zhì)粒中擴增VP3的DNA序列,與pShuttle-IRES-hrGFP-2進行連接構(gòu)建pShuttle-VP3-hrGFP穿梭質(zhì)粒,PCR和EcoRⅤ酶切電泳鑒定;穿梭質(zhì)粒pShuttle-VP3-hrGFP經(jīng)Pmel酶切線性化后,轉(zhuǎn)化含pAdeasy-1

2、的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌,細菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP3-hrGFP,質(zhì)粒經(jīng)PCR、PacI酶切電泳及測序鑒定,線性化的腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD293細胞,進行重組腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包裝和擴增,采用CsCI密度梯度離心法進行病毒濃縮和純化并將其感染人結(jié)腸癌SW480細胞中進行表達,觀察其感染效率及表達水平。
　　結(jié)果：pShuttle-VP3-hrGFP穿梭質(zhì)粒構(gòu)建鑒定成功。線性化的pSh

3、uttle-VP3-hrGFP轉(zhuǎn)化含pAdeasy-1的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反應(yīng)擴增出了402bp的片段,重組質(zhì)粒測序證實VP3-hrGFP編碼區(qū)成功地克隆入了腺病毒pAd中,且其序列與GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包裝出攜帶VP3基因的腺病毒,滴度為1.738×1012opu/ml,獲得的重組腺病毒對SW480細胞的感染效率高于98％以上