IntegrinαⅤ在結(jié)腸癌群集耐藥中作用及機制的研究.pdf

1、目的：研究integrinαV在結(jié)腸癌群集耐藥中的作用及其作用機制。 材料與方法：采用人結(jié)腸高分化腺癌細(xì)胞株HT29與LIM1863為研究對象，瓊脂糖抑制細(xì)胞貼壁、間斷水平回旋振蕩方法建立HT29多細(xì)胞球模型。加入梯度濃度奧沙利鉑作用2天，Cellcountingkit-8檢測細(xì)胞對奧沙利鉑的藥物敏感性。PCR擴增質(zhì)粒pEGFP-N2的EGFP與CMV，并將其插入pSUPER.neo，構(gòu)建pSUPER.neo.EGFP。合成分別

2、針對integrinαV、NFkappaB、JNK1、JNK2干擾的特異性DNA，并將其插入pSUPER.neo.EGFPR的H1啟動子下游HindⅢ、BglⅡ之間，而后用EeoRⅠ、XhoⅠ將H1啟動子、特異性干擾片段、CMV及EGFP-并酶切下來，插入逆轉(zhuǎn)錄病毒pLXSN，從而構(gòu)建成功可特異干擾integrinαV、NFkappaB、JNK1、JNK2表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒。分別將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HT29與LIM1863，G418

3、篩選，并連續(xù)多次挑選單克隆，從而得到穩(wěn)定表達逆轉(zhuǎn)錄病毒的，integrinαV、NFkappaB、JNK1、JNK2分別被特異性沉默的HT29細(xì)胞株(HT29/IntegrinαV-、HT29/NFkappaB-、HT29/JNK1-、HT29/JNK2-)與LIM1863細(xì)胞(LIMl863/IntegrinaV-；LIM1863/NFkappaB-、LIM1863/JNK1-、LIM1863/JNK2-)。將細(xì)胞分組，以奧沙利鉑30

4、0μg/L處理1小時作為化療組的干預(yù)因素。SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞得到全細(xì)胞蛋白，Bio-Rad公司RCDCProteinAssay檢測蛋白濃度，WesternBlot檢測蛋白的表達量。Pierce公司NE-PER（）NuclearandCytoplasmicExtractionReagents提取核蛋白，Bradford比色法檢測核蛋白濃度。Pierce公司LightShiftChemiluminescentEMSAKit化學(xué)發(fā)光法E

5、MSA檢測核蛋白NFkappaB活性。為排除空載體對實驗結(jié)果的干擾，相同方法檢測了空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的各項指標(biāo)。分別取對數(shù)生長期的HT29細(xì)胞與HT29/IntegrinαV-、HT29/NFkappaB-、HT29/JNK1-、HT29/JNK2-細(xì)胞按2×107/只接種于6周齡雌性BALB/cnu/nu裸鼠前腋皮下，48小時后，按10mg/kg體重給予奧沙利鉑處理。觀察30天后處死，瘤體稱重。單因素方差分析統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。 結(jié)果

6、： 一、成功建立HT29多細(xì)胞球培養(yǎng)模型。 1、倒置顯微鏡下可見細(xì)胞聚集成團；掃描電鏡見多細(xì)胞球細(xì)胞黏附緊密，表面凹凸不平；HE染色顯示多細(xì)胞球由多層細(xì)胞組成，隨細(xì)胞球體積增大，中心出現(xiàn)壞死區(qū)。 2、HE染色顯示，隨著時間的延長，多細(xì)胞球內(nèi)HT29細(xì)胞出現(xiàn)分化。細(xì)胞排列有序，形成腺管、腺腔樣結(jié)構(gòu)；與LIM1863形成的腺腔、腺管相同。 3、透射電鏡下，HT29多細(xì)胞球及LIM1863都表現(xiàn)為細(xì)胞相互黏附；

7、細(xì)胞連接常見，特別是緊密連接，而單層細(xì)胞則未見細(xì)胞連接；線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達；微絨毛長而豐富。 二、HT29多細(xì)胞球表現(xiàn)出腫瘤群集耐藥性。 HT29多細(xì)胞球?qū)W沙利鉑的藥物敏感性顯著下降。HT29多細(xì)胞球在奧沙利鉑濃度為50μg/L、500μg/L時的生存分?jǐn)?shù)(x±s)分別為0.865±0.047、0.429±0.040；HT29單層細(xì)胞則分別為0.582±0.033、0.0930±0.020；二者有顯著性差異(p＜0.0

8、5)。LIM1863在奧沙利鉑濃度為50μg/L時的生存分?jǐn)?shù)(x±s)為0.738±0.038。 三、RNA干擾integrinαV，能有效、顯著性地逆轉(zhuǎn)HT29多細(xì)胞球與LIM1863對奧沙利鉑的群集耐藥性。 1、利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾integrinαV后，Western Blot檢測示integrinαV表達明顯降低。 2、WesternBlot檢測結(jié)果示，RNA干擾integrinαV后，HT2

9、9多細(xì)胞球的磷酸化NFkappaB表達顯著下降；磷酸化JNK2表達顯著升高。 3、NFkappaB的EMSA結(jié)果顯示，沉默integrinαV后，HT29多細(xì)胞球的NFkappaB活性顯著下降。 4、RNA干擾integrinαV后，HT29多細(xì)胞球在奧沙利鉑濃度為500μg/L時的生存分?jǐn)?shù)降低為0.300±0.037(p＜0.05)；而LIM1863在奧沙利鉑濃度為50μg/L時的生存分?jǐn)?shù)降低為0.638±0.0296

10、0＜0.05)。 5、裸鼠皮下種植瘤結(jié)果顯示，RNA干擾integrinαV的HT29對奧沙利鉑的藥物敏感性顯著高于HT29奧沙利鉑化療組，二者的腫瘤平均重量(x±s)分別為(單位：g。下同。)，0.94±0.34，0.71±0.36(p＜0.05)。 四、RNA干擾NFkappaB，顯著性地逆轉(zhuǎn)HT29多細(xì)胞球與LIM1863對奧沙利鉑的群集耐藥性。 1、利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi沉默NFkappaB后，

11、WestemBlot檢測示NFkappaB表達明顯降低，EMSA顯示NFkappaB活性也被抑制。 2、WestemBlot檢測結(jié)果示，化療后，HT29多細(xì)胞球的磷酸化NFkappaB表達顯著升高；EMSA結(jié)果顯示的NFkappaB活性變化趨勢與WesternBlot相同。 3、RNA干擾NFkappaB后，HT29多細(xì)胞球的磷酸化JNK2表達顯著升高。 4、RNA干擾NFkappaB后，HT29多細(xì)胞球?qū)W沙利

12、鉑藥物敏感性的變化趨勢與RNA干擾integrinαV相同。在奧沙利鉑濃度為500μg/L時，HT29多細(xì)胞球的生存分?jǐn)?shù)降低為0.346±0.038(p＜0.05)；而LIM1863在奧沙利鉑濃度為500g/mL下的生存分?jǐn)?shù)降低為0.668±0.037(p＜0.05)。 5、HT29/NFkappaB一種植瘤在奧沙利鉑化療后，平均瘤重下降為0.76+0.43(p＜0.05)。 五、RNA干擾JNK1基因，HT29單層細(xì)胞

13、、HT29多細(xì)胞球與LIM1863對奧沙利鉑的藥物敏感性無顯著性改變，雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi能有效降低其表達。 六、RNA干擾JNK2基因，顯著增加了HT29多細(xì)胞球與LIM1863對奧沙利鉑的群集耐藥性。 1、利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi沉默K2后，WesternBlot檢測示，JNK2表達明顯降低，磷酸化JNK2表達也被有效抑制。 2、RNA干擾JNK2后，HT29多細(xì)胞球在奧沙利鉑濃度為500

14、μg/L時的生存分?jǐn)?shù)升高為0.493±0.032(p＜0.05)；而LIM1863在奧沙利鉑濃度為50g/mL下的生存分?jǐn)?shù)升高為0.798±0.038(p＜0.05)。 3、HT29/JNK2-裸鼠皮下種植瘤結(jié)果與多細(xì)胞球結(jié)果趨勢一致。瘤重升高為1.10±0.46(p＜0.05)。 結(jié)論： 1、HT29多細(xì)胞球能較好地模擬體內(nèi)尚未形成血管的微小實體瘤，為缺氧、細(xì)胞間黏附、細(xì)胞連接以及分化等研究提供了較好的細(xì)胞模型

15、。 2、建立了一套可以有效進行RNAi的普通質(zhì)粒.逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒系統(tǒng)，可穩(wěn)定地、有效地、特異性沉默目的基因。 3、細(xì)胞黏附分子integrinαV的激活是結(jié)腸癌群集耐藥產(chǎn)生的重要原因之一，其機制與激活NFkappaB從而抑制JNK2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。 4、干擾integrinαV的表達，或阻斷其激活NFkappaB、抑制JNK2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以有效地逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌群集耐藥。 5、沉默JNK1基因?qū)Y(jié)腸癌群集