己糖激酶-Ⅱ在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和化療中的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文己糖激酶Ⅱ在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和化療中的作用及調(diào)控機(jī)制姓名：彭秋平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：梁后杰20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文信號(hào)通路中位于Akt下游的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在許多惡性腫瘤細(xì)胞明顯活化。mTOR信號(hào)通路是否可通過(guò)調(diào)控HK—II表達(dá)來(lái)影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及化療敏感性還不清楚。本課題擬通過(guò)抑制HK—II，觀察結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、化療敏感性和凋亡相關(guān)因子的變化，以探討HK—II在結(jié)腸癌細(xì)胞增

2、殖和化療中的作用及機(jī)制；通過(guò)抑制mTOR，觀察結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、化療敏感性以及HK—II表達(dá)的變化，以探討mTOR信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HK—II表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。方法1采用RTPCR和Western印跡法，檢測(cè)4種人結(jié)腸癌細(xì)胞株HK—II基因和mTOR基因mRNA和蛋白表達(dá)。2應(yīng)用MTT、DNA瓊脂糖凝膠電泳、Hoechst33258核染色及比色法，觀察HK—II阻斷藥物(3一bromopyruvicacid，5BrPA)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、

3、凋亡和化療的影響。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondriamembranevoltage，Aqm)、紫外分光光度計(jì)測(cè)定線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孑k(permeabilitytransitionpores，PTP)開(kāi)放及Western印跡法檢測(cè)線粒體結(jié)合型HK—II表達(dá)，探討5一BrPA拮抗HK—II與線粒體結(jié)合導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡機(jī)制。3構(gòu)建靶向HK—II基因的短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒(p

4、Genesil一1一HK—II)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分三組：1組為正常培養(yǎng)組LoVo細(xì)胞，2組為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil一1一HK—II的LoVo細(xì)胞陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組，3組為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil一1的LoVo細(xì)胞陰性對(duì)照組。采用MTT法、流式細(xì)胞儀、Western印跡法及高效液相色譜儀(highperformanceliquidchromatography，HPLC)，檢測(cè)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖、克隆形成能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞

5、內(nèi)ATP含量、胸苷酸合成酶(thymidylatesynthase，TS)以及化療敏感性的變化。將上述三組LoVo細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，4周后測(cè)量皮下瘤體積和稱重，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織Ⅺ一67表達(dá)，TUNEL法分析細(xì)胞凋亡。4在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)mTOR阻斷劑(雷帕霉素，rapamycin)矛NRNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)抑制mTOR，應(yīng)用MTT法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、化療敏感性變化，以及r