PHD2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解活性的調(diào)控作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、一、背景
　　 正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中伴隨著代謝途徑的重塑，其中最典型的是腫瘤細(xì)胞即便在氧氣供應(yīng)充足的情況下也主要以糖酵解而非氧化磷酸化提供能量，這種糖代謝途徑的重塑被稱為有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)。該表型可促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡耐受、生物合成前體分子生成增加以及侵襲能力增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞能量代謝的適應(yīng)性改變也是導(dǎo)致腫瘤對(duì)放化療耐受的重要原因。目前，腫瘤糖代謝重塑的分子基礎(chǔ)和確切機(jī)制尚未完全闡明。
　　 實(shí)體腫瘤在

2、不斷生長的過程中，其中心會(huì)形成缺氧環(huán)境。腫瘤細(xì)胞為應(yīng)對(duì)缺氧的壓力，遂啟動(dòng)異常活躍的糖酵解，同時(shí)啟動(dòng)促血管機(jī)制以增加腫瘤血管形成，從而使自身得以存活和生長。在這一過程中，感受瘤體內(nèi)氧分壓的改變并及時(shí)啟動(dòng)腫瘤糖酵解是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們推測，作為細(xì)胞內(nèi)最重要的氧感受器，脯氨酸羥化酶(prolylhydroxylases，PHDs)可能是上述關(guān)鍵環(huán)節(jié)的關(guān)鍵分子。
　　 現(xiàn)已證實(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有三種類似的酶-PHD1、PHD2和PHD

3、3，它們都含有α、β兩個(gè)亞基，其中α亞基有脯氨酸羥化酶的活性。常氧時(shí)，PHD可將缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α的兩個(gè)脯氨酸殘基羥基化，介導(dǎo)其被蛋白酶體降解。現(xiàn)已證實(shí)，PHD2是HIF-1α最重要的調(diào)控因子。此外研究發(fā)現(xiàn)，PHD2在多種腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織中表達(dá)缺失，提示其可能具有抑癌作用。目前已發(fā)現(xiàn)PHD2與腫瘤血管生成密切相關(guān)，且已證實(shí)腫瘤細(xì)胞能量代謝的改變早于腫瘤血管生成，那么PHD2

4、是否在腫瘤糖酵解代謝方面發(fā)揮作用，目前還有待研究。本研究擬采用基因干擾重建、免疫共沉淀等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象，首先通過干擾或重建PHD2表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞在葡萄糖攝取、乳酸及能量分子生成等方面的相應(yīng)變化，以明確PHD2對(duì)腫瘤糖酵解代謝的調(diào)控作用；進(jìn)而研究主要能量相關(guān)通路在PHD2上述調(diào)控作用的活化情況，以期進(jìn)一步闡明PHD2調(diào)控腫瘤糖酵解的分子機(jī)制。本研究不僅有助于加深對(duì)腫瘤糖酵解代謝機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且能為針對(duì)腫瘤糖

5、酵解的有效靶向治療提供新策略。
　　 二、目的
　　 明確PHD2對(duì)腫瘤糖酵解代謝的調(diào)控作用，進(jìn)一步闡明PHD2調(diào)控腫瘤糖酵解的分子機(jī)制。
　　 三、材料與方法
　　 1.采用免疫組化、Western blot及定量PCR的方法檢測人結(jié)腸癌組織及細(xì)胞PHD2及糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)，并分析其相關(guān)性。運(yùn)用Kaplan Meier生存曲線及多因素Cox模型分析PHD2在判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的臨床價(jià)值。
　

6、　 2.采用RNA干擾、特異性抑制劑和基因過表達(dá)的方法，抑制結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞PHD2及上調(diào)SW480細(xì)胞的PHD2，利用Western blot檢測PHD2及糖酵解相關(guān)蛋白HK2、PDK1和Glut1的表達(dá)，采用液閃測量、酶標(biāo)法、高效液相層析檢測上述PHD2抑制或表達(dá)重建細(xì)胞的葡萄糖攝取量、乳酸生成量及ATP/ADP比值。利用Mitotracker檢測細(xì)胞的線粒體數(shù)量。
　　 3.采用液閃測量、酶標(biāo)法、高效液相層析檢測P

7、HD2和HIF-1α雙干擾LS174T細(xì)胞的葡萄糖攝取量、乳酸生成量及ATP/ADP比值。利用Western blot和ELISA檢測抑制PHD2表達(dá)的LS174T細(xì)胞的LKBl/AMPK及IKK/NF-κB通路蛋白的活化情況。利用信號(hào)通路抑制劑結(jié)合液閃測量、酶標(biāo)法、高效液相層析檢測NF-κB通路抑制劑對(duì)PHD2抑制的LS174細(xì)胞糖酵解效應(yīng)。利用免疫共沉淀判斷NF-κB信號(hào)通路蛋白與PHD2的相互作用。
　　 四、結(jié)果

8、　　 1.PHD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常結(jié)腸組織。所檢測結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞僅LS174有稍高水平的PHD2表達(dá)，而其它細(xì)胞系均維持較低水平。結(jié)直腸癌組織中HK2、PDK1、Glut1 mRNA表達(dá)水平與配對(duì)癌旁組織之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KaplanMeier生存分析表明PHD2低表達(dá)的早期結(jié)直腸癌患者預(yù)后顯著差于高表達(dá)患者。多因素Cox模型分析發(fā)現(xiàn)，PHD2在結(jié)直腸癌患者中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　 2.DMOG對(duì)

9、結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T細(xì)胞PHD2蛋白表達(dá)的抑制呈濃度依賴。利用DMOG處理LS174T細(xì)胞后可促進(jìn)糖酵解。采用PHD2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LS174T細(xì)胞后，其葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)量以及ATP/ADP比值均顯著增加。用PHD2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PHD2的SW480細(xì)胞的糖酵解相關(guān)分子包括Glut1、HK2、PDK1的表達(dá)均顯著被抑制，其葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)量以及ATP/ADP比值顯著下降

10、>　　 3.HIF-1α抑制并不能影響PHD2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解活性的調(diào)控作用；NF-κB信號(hào)通路的活化參與PHD2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解的調(diào)控；磷酸化AMPK可隨DMOG濃度的增加而上調(diào)。
　　 五、結(jié)論
　　 1.PHD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著減少。PHD2可作為早期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后指標(biāo)。
　　 2.PHD2對(duì)結(jié)腸癌糖酵解活性方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。
　　 3.PHD2調(diào)控結(jié)腸癌糖酵解活性不