模擬缺氧條件下結(jié)腸癌細胞耐藥及抗凋亡分子機制研究.pdf

1、微環(huán)境缺氧是大多數(shù)實體腫瘤的顯著特征之一，對腫瘤的預后有明顯影響，缺氧誘導因子1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是適應缺氧的主要轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵調(diào)控單位，通過多種機制促進腫瘤生存，尤其是細胞對化療藥物敏感性的變化，并有多種分子參與了該過程，成為了實體腫瘤患者化療失敗最重要的原因之一。由于其分子機制尚未完全闡明，并且存在細胞特異性，至今仍未發(fā)現(xiàn)行之有效的逆轉(zhuǎn)方法。因此從分子機制闡明并尋找從缺氧發(fā)生到耐藥表

2、型形成過程中的主要分子十分重要。近年來，有研究稱HIF-1可能是缺氧誘導實體瘤產(chǎn)生耐藥和抗凋亡的一個上游關(guān)鍵分子。因此，探討HIF-1在缺氧環(huán)境誘導結(jié)腸癌耐藥及對抗凋亡的分子機制，將有助于全面深入闡明在缺氧微環(huán)境下腫瘤細胞的生物學表型變化，為今后的靶向治療提供理論依據(jù)和分子靶點。
　　 目的：
　　 在細胞水平上觀察CoCl2模擬缺氧條件下人結(jié)腸癌Lovo細胞的增殖和對化療藥物敏感性的變化，分子水平上研究多種耐藥相關(guān)基因

3、和凋亡相關(guān)蛋白的變化。探討微環(huán)境缺氧對結(jié)腸癌化療耐藥的影響及相互作用，為今后結(jié)腸癌的治療提供作用靶點。
　　 方法：
　　 本實驗采用二氯化鈷（CoCl2）建立缺氧模型，MTT法中細胞均用96孔板培養(yǎng)，用于RT-PCR，Western-blot和流式細胞分析的細胞均用6孔板培養(yǎng)。
　　 1.利用MTT比色法檢測不同程度缺氧條件對結(jié)腸癌Lovo細胞生長曲線的影響。
　　 2.利用MTT比色法檢測模擬缺氧條件

4、下氟尿嘧啶（FU）對Lovo細胞的抑制率的影響，設(shè)對照孔和空白孔。
　　 3.在含不同CoCl2濃度培養(yǎng)基作用相同時間后，利用RT-PCR檢測HIF-1α、MDR1、MRP、BCRP和LRP基因的mRNA水平的變化，以β-actin作為內(nèi)參照。
　　 4.在含不同CoCl2濃度培養(yǎng)基處理相同時間后，利用Western-blot檢測HIF-1α Bcl-2、Bax和Bad蛋白水平的變化，以β-actin作為內(nèi)參照。

5、　　 5.利用流式細胞術(shù)（FCM）觀察在常氧和模擬缺氧條件下結(jié)腸癌細胞系內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留變化，間接反應耐藥基因的對化療藥物轉(zhuǎn)運作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.用CoCl2模擬腫瘤體內(nèi)缺氧微環(huán)境，采用MTT法測定細胞的生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著CoCl2濃度增加，細胞對數(shù)生長期較對照組有所提前，生長速度減慢，尤其在250μmol/L時細胞生長則呈明顯抑制狀態(tài)。
　　 2.腫瘤細胞在不同CoCl2濃度后，觀察FU作

6、用24h腫瘤生長抑制率的變化情況，發(fā)現(xiàn)在100μmol/L，150μmol/L和200μmol/L處理后的Lovo細胞對FU的敏感性下降，低于對照組，p<0.05。而在250μmol/L的濃度下抑制率卻明顯增加，高于未用對照組，p<0.05。
　　 3.在不同CoCl2濃度梯度培養(yǎng)24h后觀察HIF-1α及多種耐藥基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。經(jīng)RT-PCR分析，結(jié)果顯示，相同作用時間下，隨著CoCl2濃度的遞增，HIF-1α和LR

7、P的mRNA轉(zhuǎn)錄水平未見明顯變化，而mdr-1，MRP和BCRP的轉(zhuǎn)錄逐漸增高，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，p<0.05。
　　 4.不同CoCl2濃度梯度處理24h后，觀察HIF-1α及凋亡相關(guān)因子蛋白表達變化。western-bolt分析，結(jié)果顯示，相同作用時間下，隨著CoCl2濃度的遞增，HIF-1α蛋白表達增高，而Bax和Bad的蛋白表達則逐漸減低，呈現(xiàn)劑量依賴性，Bcl-2表達無明顯變化。Bcl-2與Bax的比值隨CoCl

8、2濃度的遞增而降低。
　　 5.利用FCM檢測模擬缺氧和常氧下結(jié)腸癌Lovo細胞內(nèi)阿霉素（ADR）蓄積和潴留變化水平。結(jié)果顯示，與常氧組相比缺氧組中，一定時間內(nèi)Lovo細胞中ADR的蓄積無明顯變化，ADR潴留水平則顯示缺氧組較常氧組明顯減少。
　　 結(jié)論：
　　 1.缺氧環(huán)境下人結(jié)腸癌Lovo細胞增殖水平降低；
　　 2.在適度的缺氧條件下FU對結(jié)腸癌的抑制率降低，但缺氧增加到一定程度抑制率反而增加；