Periostin基因在結腸癌轉移和耐藥性中的作用及機制的研究.pdf

1、第一章:Periostin基因在人結腸癌中的表達及臨床意義
　　目的:結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高結腸癌患者生存率的關鍵所在。目前有很多非侵入性結腸癌篩查方法，血清癌胚抗原(CEA)篩查是最常見的方法之一。然而，CEA診斷結腸癌的敏感性和特異性較低。Periostin是最近發(fā)現(xiàn)的一種細胞基質蛋白，在多種組織尤其是在惡性腫瘤組織內過表達。本部分的研究目的為確定Periostin在結腸癌中的表達及臨床

2、意義。
　　方法:健康對照組:隨機挑選來我院體格檢查正常者共12例，其中男性6例，女性6例，年齡48-75歲。結腸癌病人組:隨機挑選2011年4月-2012年4月住院的20例結腸癌患者，年齡38-81歲，平均年齡為62歲，男性13例，女性7例。所有病例均經(jīng)病理檢查確診，術前CEA檢測資料齊備，并且未接收任何術前放化療。其中淋巴結轉移11例(55％)、肝轉移6例、肺轉移1例，組織學分化程度有高分化、中分化、低分化各5、7、8例。臨床

3、病理TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期分別為5、4、4和7例。正常癌旁組織為取自同一手術切除標本且距腫瘤邊緣約5-8cm。分別應用半定量RT-PCR和Westernblot法檢測結腸癌組織和正常組織中Periostin基因mRNA和蛋白表達水平。應用ELISA法檢測結腸癌患者和正常對照血清Periostin濃度，并分析血清Periostin濃度與結腸癌臨床病理參數(shù)的相關性。
　　結果:RT-PCR檢測結果顯示:結腸癌組織中Periosti

4、n mRNA豐度明顯高于癌旁正常組織。經(jīng)過灰度分析發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中Periostin/GAPDH的值為1.35±0.61，而在癌旁正常組織中Periostin/GAPDH的值為0.33±0.21。兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western blot法檢測結果表明:Periostin蛋白質的表達量在結腸癌中顯著高于癌旁正常結腸組織(P＜0.05)。ELISA實驗結果顯示，在結腸癌病人血清中Periostin蛋白含量顯著

5、高于對照組正常人血清中Periostin的含量，分別為55.04±11.50ng/mL和23.31±6.72ng/mL，兩者差異具有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。血清Periostin濃度與結腸癌病人淋巴結轉移、遠端轉移以及TNM分期顯著相關，濃度越高，腫瘤惡性度越高。然而，其血清濃度與病人年齡、性別、腫瘤大小和血清CEA水平無明顯相關性。
　　結論:Periostin基因在結腸癌組織中表達上調。結腸癌病人血清Periostin濃度顯

6、著高于健康正常人。血清Periostin濃度與結腸癌淋巴結轉移、遠端轉移和高級別腫瘤分期顯著相關。
　　第二章:Periostin基因在結腸癌轉移中的作用及機制
　　目的:遠端轉移是惡性腫瘤患者死亡的重要原因。上皮-間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細胞獲得侵襲能力的一個關鍵事件。本部分研究目的為檢測Periostin對細胞增殖、集落形成、粘附、侵襲、EMT等生物學行

7、為的影響。
　　方法:應用RT-PCR技術從結腸癌組織中擴增全長人PeriostincDNA，并將其克隆至pcDNA3.1(+)表達載體，構建人Periostin基因真核表達質粒。將pcDNA3.1-Periostin重組質?；蚩蛰d體分別轉染人結腸癌細胞HT-29和SW480，應用G418篩選，建立Periostin穩(wěn)定轉染細胞系。應用MTT法測定細胞增殖改變;應用軟瓊脂集落形成實驗測定細胞形成集落的能力;應用細胞黏附實驗測定細胞

8、黏附能力的改變;應用體外侵襲實驗測定細胞侵襲能力的改變。倒置相差顯微鏡觀察轉染空載體或Periostin表達質粒SW480細胞形態(tài)變化，并應用Western blot法檢測上皮細胞標志物E-cadherin和間質細胞標志物Vimentin的表達水平變化。
　　結果:與未轉染和轉染空載體質粒的結腸癌細胞相比，轉染pcDNA3.1-Periostin重組質粒結腸癌細胞Periostin水平顯著增加，提高大約8-10倍。轉染Perios

9、tin重組質粒、轉染空載體質粒及未轉染對照細胞增殖速度類似，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。pcDNA3.1-Periostin轉染SW480和HT-29細胞集落形成率分別為78±7％和67±13％，而轉染空載體對照SW480和HT-29細胞集落形成率分別為80±14％和64±11％，經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。應用體外細胞與基質粘附實驗，通過酶標儀在570nm測定吸光度值，觀察對照組細胞與實驗組細胞對Ⅰ型膠原蛋白粘附

10、能力的變化。結果發(fā)現(xiàn)實驗組的OD值均顯著高于對照組OD值，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05): SW480對照和實驗組OD值分別為0.43±0.09和0.77±0.08; HT-29對照和實驗組OD值分別為0.59±0.09和0.94±0.09。Transwell侵襲實驗檢測結果顯示，轉染空載體的SW480細胞（對照組）培養(yǎng)24 h后穿膜細胞數(shù)為51±7個/視野;Periostin表達質粒轉染組培養(yǎng)24 h后穿膜細胞數(shù)達到98±9個/視野

11、，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。倒置相差顯微鏡觀察結果顯示對照組SW480細胞仍保持上皮細胞形態(tài)，而轉染Periostin重組質粒細胞則變?yōu)殚L梭狀，為典型的間質細胞形態(tài)。Periostin轉染細胞E-cadherin表達量下降而Vimentin蛋白表達量明顯增加。
　　結論:Periostin基因在結腸癌中具有促進腫瘤細胞粘附和侵襲的能力以及誘導結腸癌細胞發(fā)生EMT的能力。但Periostin基因對結腸癌細胞增

12、殖和成瘤能力影響不顯著。
　　第三章:Periostin基因在結腸癌耐藥性中的作用及機制
　　目的:目前廣泛用于結腸癌化療的藥物主要有三種，即氟尿嘧啶(Fluoropyrimidines)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)和伊立替康(Irinotecan)。它們可以單獨使用也可以聯(lián)用。本部分研究目的為揭示Periostin基因在結腸癌耐藥性中的功能并探討相關分子機制。
　　方法:Oxaliplatin或5-FU處理S

13、W480和HT-29細胞0-48 h后，應用Western blot和RT-PCR法分別檢測Periostin蛋白和mRNA表達水平。SW480和HT-29細胞轉染Periostin siRNA或對照siRNA，24小時后加入Oxaliplatin或5-FU處理48小時后，應用Annexin-(Ⅴ)染色法測定細胞凋亡，并應用Western blot法測定切割型caspase-3和PARP以及Survivin蛋白表達水平。應用PCR法擴增

14、全長人survivin基因，并將其克隆至真核表達載體，構建Survivin重組質粒。survivin基因與Periostin siRNA共轉染SW480和HT-29細胞，孵育24小時后，應用Oxaliplatin或5-FU處理48小時，應用Annexin-(Ⅴ)染色法測定細胞凋亡的變化。SW480和HT-29細胞轉染Periostin表達質粒24小時后，應用Western blot法檢測Survivin、總Akt和磷酸化Akt蛋白水平。

15、應用PI3K特異抑制劑LY294002(20μM)預處理SW480和HT-29細胞1小時，然后再轉染Periostin表達質粒，應用Western blot法測定Survivin蛋白表達水平的變化。
　　結果:Oxaliplatin和5-FU處理SW480和HT-29結腸癌細胞24h和48 h后可明顯誘導Periostin蛋白和mRNA水平增加。轉染PeriostinsiRNA可顯著抑制藥物誘導的Periostin表達上調。Ann

16、exinⅤ—FITC和PI雙染法顯示，與轉染對照siRNA組相比，siRNA法引起的Periostin基因表達下調可顯著增強Oxaliplatin和5-FU誘導的SW480細胞凋亡，凋亡細胞比例分別從10％和7％升至18％和20％。在HT-29細胞中可觀察到類似的現(xiàn)象，Oxaliplatin和5-FU誘導的凋亡細胞百分比分別從對照組的6％和9％升至實驗組的15％和22％。Western blot結果顯示，在化學藥物刺激條件下，轉染Per

17、iostin siRNA的SW480和HT-29細胞中切割caspase-3和PARP蛋白水平較對照細胞顯著增加，而Survivin蛋白水平較對照組細胞明顯降低。過表達Survivin基因顯著抑制Oxaliplatin或5-FU誘導的Periostin基因沉默結腸癌細胞凋亡，與未轉染Survivin表達質粒組相比，凋亡率下降了約50％。Western blot法檢測結果顯示，Periostin過表達可導致SW480和HT-29細胞中Ak