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文檔簡介
1、背景與目的
結腸癌是我國發(fā)病率很高的惡性腫瘤,其重要的治療手段化療,由于多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)現(xiàn)象,常導致化療效果的降低,嚴重影響了結腸癌患者的生存期和生存質量。因此多藥耐藥現(xiàn)象成為臨床迫切需要解決的問題,以往對結腸癌多藥耐藥的研究多集中在多藥耐藥相關蛋白(multidrugrelated protein,MRP)及P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)等方面。近年來發(fā)現(xiàn)
2、神經(jīng)酰胺糖基化水平的提高可能是腫瘤細胞多藥耐藥的一個新機制,而葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(glucosylcemmide synthase,GCS)是神經(jīng)酰胺糖基化的關鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)GCS可以使神經(jīng)酰胺糖基化為無細胞毒性的葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide,GlcCer),減少細胞凋亡,促進腫瘤細胞多藥耐藥發(fā)生。
本研究首先用RT-PCR、免疫細胞化學法檢測了GCS在兩種結腸癌細胞系HCT-8和HCT-8/VCR中
3、的表達情況,然后將靶向GCS的UGCG shRNA Plasmid轉染入人結腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR,檢測轉染后GCS的表達水平和對多藥耐藥的影響,。本課題從基因、蛋白等方面研究GCS與結腸癌發(fā)生、發(fā)展以及多藥耐藥產生的關系,并運用RNA干擾技術下調GCS的表達觀察能否逆轉結腸癌多藥耐藥,為臨床提高結腸癌化療敏感性多藥耐藥的逆轉和提供一定的理論方向。
方法:
1常規(guī)培養(yǎng)HCT-8/VCR和HCT-8兩種
4、細胞,其中HCT-8/VCR細胞培養(yǎng)液中加入長春新堿(vincristine,VCR)2ug/ml,以維持其相應的耐藥表型。開始測定前撤藥,進行無藥培養(yǎng)2周。
2用RT-PCR在mRNA水平、用細胞免疫化學法在蛋白水平測定GCS在HCT-8和HCT-8/VCR兩種細胞中的表達。
3用細胞活性(Cell Counting kit-8,CCK-8)法,測定HCT-8和HCT-8/VCR對VCR、5-氟尿嘧啶(5-
5、FU)和順鉑(DDP)的耐藥情況。
4 UGCG shRNA Plasmid轉染HCT-8/VCR細胞。
5 RT-PCR在mRNA水平、western blot在蛋白水平上檢測HCT-8/VCR轉染UGCG shRNA Plasmid后GCS表達的情況。
6 CCK-8法檢測轉染UGCG shRNA Plasmid后HCT-8/VCR細胞對VCR、5-FU和DDP的敏感性。
結果
6、:
1 RT-PCR、免疫細胞化學結果表明:GCS在HCT-8和HCT-8/VCR細胞中均有表達。RT-PCR結果顯示,GCSmRNA的相對表達量HCT-8為0.25±0.02,HCT-8/VCR為0.98±0.01,耐藥細胞HCT-8/VCR表達水平較高,顯著高于親本細胞HCT-8(p<0.05);免疫細胞化學結果顯示,GCS蛋白的相對表達量HCT-8為91.51±1.20,HCT-8/VCR為118.44±1.56,耐
7、藥細胞HCT-8/VCR表達水平較高,顯著高于親本細胞HCT-8(p<0.05)。
2 CCK8分析結果顯示:HCT-8/VCR細胞對VCR、5-FU和DDP的IC50均高于HCT-8細胞(p<0.05)。表明HCT-8/VCR對VCR、5-FU、DDP等多種化療藥物耐藥,具有多藥耐藥性。
3 RT-PCR和Western blot結果顯示轉染UGCG shRNA Plasmid后的HCT-8/VCR的GCS
8、mRNA和蛋白的相對含量明顯低于HCT-8(p<0.05);表明靶向GCS的UGCG shRNA Plasmid成功了的降低了GCS的表達。
4 CCK8檢測轉染UGCG shRNA Plasmid后的HCT-8/VCR細胞結果顯示,與轉染前比較,轉染后HCT-S/VCR細胞對ADR、VCR、5-FU和DDP的IC50減小,敏感性增高。
結論:
1結腸癌細胞HCT-8和HCT-8/VCR中均存在
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