GCS通過影響B(tài)CL-2的表達介導(dǎo)結(jié)腸癌細胞的多藥耐藥.pdf

1、背景與目的：
　　在現(xiàn)階段，化療依然是治療終末期腫瘤的主要手段，而腫瘤細胞多藥耐藥的形成是導(dǎo)致化療失敗的直接原因，導(dǎo)致預(yù)后不良。多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細胞在對某一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后，對其他化學(xué)作用原理不同、結(jié)構(gòu)各異的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。神經(jīng)酰胺在抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡方面起著重要作用，而葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（GCS）可以催化神經(jīng)酰胺糖基化生成葡萄糖神經(jīng)酰胺（GlcCer），從而可以逃避神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的腫瘤凋亡。越

2、來越多的證據(jù)表明，腫瘤細胞多藥耐藥的形成與細胞內(nèi)葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶水平升高有著密切的關(guān)系。細胞中ERK蛋白的高表達可以促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調(diào)，作用于細胞凋亡的下游共同通路，發(fā)揮抗凋亡作用，Bcl-2的抗凋亡作用已被證實參與腫瘤細胞多藥耐藥的形成，有文獻報道，白血病耐藥細胞中存在GCS與Bcl-2的共同高表達[1]。但目前GCS與Bcl-2的關(guān)系及作用機制在結(jié)直腸癌中報道甚少。
　　本研究旨在通過檢測結(jié)腸癌敏感株細胞H

3、CT-8、耐藥細胞HCT-8/VCR及加入GCS抑制劑PPMP后，各組細胞中GCS、Bcl-2及ERK的表達情況，探討其相互關(guān)系及可能的作用機制。
　　方法：
　　1細胞株的培養(yǎng)
　　1）HCT-8組：結(jié)腸癌敏感細胞HCT-8在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各100 U/mL)中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度。至少培養(yǎng)2周后，取對數(shù)期生長良好的細胞進行實驗。

4、r>　　2）HCT-8/VCR組：結(jié)腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR在含1.0μg/ml VCR的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以維持其耐藥性。實驗在脫藥培養(yǎng)2周，取對數(shù)期生長良好的細胞進行。
　　3）HCT-8/VCR+PPMP組：HCT-8/VCR細胞株脫藥培養(yǎng)后，繼續(xù)在含有20μmol/L PPMP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后進行實驗。
　　2蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）
　　收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-

5、8/VCR+PPMP組細胞，提取總蛋白，Western Blot檢測各組細胞GCS、Bcl-2及ERK蛋白的表達情況。
　　3熒光定量PCR法（RT-qPCR）
　　收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組的細胞，提取RNA，RT-qPCR檢測各組細胞GCS、Bcl-2及ERK基因的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1．結(jié)腸癌敏感細胞HCT-8及耐藥細胞HCT-8/VCR中均有GCS和抗凋

6、亡蛋白 Bcl-2的表達，耐藥細胞株中 GCS的表達高于敏感細胞株，差異顯著（P＜0.05）；并且Bcl-2在耐藥株中的表達也明顯高于敏感株細胞（P＜0.05），與GCS具有一致性。
　　2．HCT-8/VCR組與 HCT-8/VCR+PPMP組相比，加入 GCS抑制劑 PPMP后，明顯抑制了 GCS的表達（P＜0.05）；同時，在 HCT-8/VCR+PPMP組抗凋亡蛋白Bcl-2與ERK蛋白的表達較HCT-8/VCR組下降（P

7、＜0.05）。
　　3．RT-qPCR檢測HCT-8/VCR組與HCT-8組目的基因，結(jié)果顯示：耐藥組細胞中GCS、Bcl-2及ERK基因都高于其親本細胞組，且差異顯著（P＜0.05）。
　　4．HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組相比，加入抑制劑組的細胞內(nèi)GCS mRNA的表達量明顯低于HCT-8/VCR組（P＜0.05）；加入抑制劑PPMP后，細胞內(nèi)Bcl-2和ERK基因的表達也較耐藥細胞組明顯下調(diào)（P＜